MTHFR基因C667T多態(tài)性與動(dòng)脈血栓性腦梗死的關(guān)聯(lián)性研究

[摘要] 目的 研究亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C667T多態(tài)位點(diǎn)對(duì)血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平的影響及其與動(dòng)脈血栓性腦梗死的相關(guān)性。 方法 選取年齡、性別及危險(xiǎn)因素匹配的動(dòng)脈血栓性腦梗死患者和對(duì)照組各84例，采用熒光定量法測(cè)定血漿Hcy水平，采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)MTHFR基因C667T位點(diǎn)進(jìn)行分型。 結(jié)果 病例組和對(duì)照組中MTHFR基因C667T位點(diǎn)基因型TT攜帶者血漿Hcy水平顯著高于基因型CC及CT攜帶者（病例組：t = 2.292，P = 0.024；對(duì)照組：t = 2.098，P = 0.039）。兩組間基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（基因型：χ2=1.313，P = 0.519；等位基因：χ2=1.296，P = 0.255）。 結(jié)論 MTHFR基因C667T位點(diǎn)等位基因T可能與血漿Hcy水平升高有關(guān)，但等位基因T可能不是動(dòng)脈血栓性腦梗死的主要危險(xiǎn)因素。

[關(guān)鍵詞] 亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態(tài)性；同型半胱氨酸；動(dòng)脈血栓性腦梗死

[中圖分類號(hào)] R743.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）17-0032-03

亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR）基因C667T多態(tài)位點(diǎn)是腦梗死遺傳易感性研究的主要候選基因之一，但研究結(jié)果存在差異[1，2]。越來越多學(xué)者提出研究差異與腦梗死異質(zhì)性有關(guān)[3，4]。MTHFR基因C667T多態(tài)位點(diǎn)上等位基因T引起機(jī)體同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平升高，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成。因此本研究以動(dòng)脈血栓性腦梗死為研究對(duì)象，探討MTHFR基因C667T多態(tài)位點(diǎn)與腦梗死的關(guān)聯(lián)性及Hcy的中介作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究病例組84例為順德均安醫(yī)院2011年2月～2012年8月住院患者，經(jīng)顱腦CT檢查，結(jié)合經(jīng)顱多普勒、頸動(dòng)脈與椎動(dòng)脈彩超結(jié)果（均存在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊或狹窄），臨床診斷動(dòng)脈血栓性腦梗死。其中男60例，女24例，平均年齡（74.1±10.1）歲。對(duì)照組為同期門診健康檢查者，其中男56例，女26例，平均年齡（72.3±9.6）歲，排除既往腦卒中、冠心病、周圍血管病、血液系統(tǒng)疾病、肝腎功能異常、嚴(yán)重感染及惡性腫瘤及2周內(nèi)服用葉酸、B族維生素史者。入選對(duì)象均為本地漢族人群。兩組間年齡、性別和危險(xiǎn)因素組成無顯著差異（表1）。本研究經(jīng)順德均安醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血漿Hcy水平測(cè)定 清晨空腹采集外周靜脈血（病例組在起病后一周采血）4 mL，2%EDTA抗凝，離心后血漿與細(xì)胞沉淀分別用于Hcy水平測(cè)定和提取基因組DNA。采用熒光生化分析技術(shù)，使用Biotech公司的Hcy試劑盒測(cè)定血漿Hcy水平。

1.2.2基因分型 采用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行MTHFR基因C667T位點(diǎn)分型。引物序列P1：5’ -CAAAGGCCACCCCGAAGC-3’，P2：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’[5]。PCR反應(yīng)體系為15 μL，常規(guī)配制。反應(yīng)條件：①94℃ 5 min；②94℃ 1 min；③64℃ 30 s；④72℃ 1 min；⑤返回34 個(gè)循環(huán)；⑥72℃ 5 min；⑦ 4℃ 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物于37℃恒溫Hinf I酶切過夜。等位基因C未經(jīng)酶切長(zhǎng)為245 bp，等位基因T被酶切至173 bp及72 bp。2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因型。純合子CC型僅有245 bp條帶，TT型顯示173 bp和72 bp兩條帶，雜合子CT型則顯示245 bp、173 bp和72 bp三條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料中用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差描述、用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均使用SPSS 11.0軟件，以α = 0.05作為有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 血漿Hcy水平

84例病例組血漿Hcy水平（4.1～30.9）μmol/L，平均（12.70±4.30）μmol/L；84例對(duì)照組血漿Hcy水平（3.6～25.8）μmol/L，平均（12.73±4.48）μmol/L。參照美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（<15 μmol/L為正常；（15～30）μmol/L輕度升高；（30～100） μmol/L中度升高；>100 μmol/L重度升高），病例組輕度升高22例，中度升高1例，無重度升高病例；對(duì)照組輕度升高21例，無中度升高和重度升高病例。兩組資料正態(tài)性檢驗(yàn)P值均>0.05。病例組與對(duì)照組間血漿Hcy水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.2 MTHFR基因C667T多態(tài)位點(diǎn)對(duì)血漿Hcy水平的影響

病例組中基因型為CC、CT和TT型者分別為44例、34例和6例；對(duì)照組中基因型為CC、CT和TT型者分別為51例、29例和4例。組內(nèi)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（病例組：P = 0.870；對(duì)照組：P = 0.962）。病例組中基因型TT攜帶者血漿Hcy水平顯著高于基因型CC和CT攜帶者（t = 2.292，P = 0.024）；對(duì)照組中基因型TT攜帶者血漿Hcy水平顯著高于基因型CC和CT攜帶者（t = 2.098， P = 0.039）?；蛐蚑T是血漿Hcy水平升高的危險(xiǎn)因素。見表2。

2.3動(dòng)脈血栓性腦梗死與MTHFR基因C667T多態(tài)位點(diǎn)

兩組間MTHFR基因C667T多態(tài)位點(diǎn)各基因型頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.313，P = 0.519）；兩組間C667T位點(diǎn)等位基因C和T頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.296，P = 0.255）。見表3。

3討論

MTHFR是體內(nèi)Hcy代謝途徑的關(guān)鍵酶。MTHFR基因第4外顯子667位點(diǎn)上存在等位基因C和T多態(tài)現(xiàn)象。一般認(rèn)為等位基因C為野生型，T為突變型。C與T對(duì)應(yīng)氨基酸殘基分別為丙氨酸和纈氨酸。纈氨酸取代丙氨酸后使MTHFR穩(wěn)定性和活性下降，引起機(jī)體Hcy蓄積，導(dǎo)致高Hcy血癥，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[6]。本研究結(jié)果顯示在病例組和對(duì)照組中，基因型TT攜帶者血漿Hcy水平最高，CT次之，CC最低；基因型TT攜帶者與CT及CC攜帶者血漿Hcy水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究相符[7，8]。

一項(xiàng)納入39 005人的Meta分析提出：預(yù)防性補(bǔ)充葉酸在降低腦卒中風(fēng)險(xiǎn)僅輕度獲益，未達(dá)到統(tǒng)計(jì)上顯著性（RR = 0.93，95%CI：0.85～1.03，P = 0.16）[9]。國(guó)內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血漿Hcy水平顯著高于對(duì)照組，但未證實(shí)Hcy水平升高是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。事實(shí)上高Hcy血癥與腦梗死的關(guān)系尚不肯定[10]。有人提出高Hcy血癥與青少年腦梗死或隱源性腦梗死關(guān)系更為密切[11]。本次研究入選對(duì)象年齡較大，平均年齡74.1歲；危險(xiǎn)因素較普遍，高血壓患病率超過71%；順德地區(qū)為珠三角小城，當(dāng)?shù)鼐用袢粘Ｖ参锸称窋z入較多。上述情況可能是本次研究未發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈血栓性腦梗死患者血漿Hcy水平與對(duì)照組相比無顯著差異的主要原因。

一項(xiàng)亞洲人群的Meta分析提示C667T位點(diǎn)與腦梗死發(fā)病顯著相關(guān)（OR = 1.47，95%CI：1.19～1.82，P = 0.0004）[12]。Kelly等一項(xiàng)包括2788例腦梗死患者和3 962例對(duì)照的Meta分析未發(fā)現(xiàn)MTHFR基因667位點(diǎn)TT基因型與腦梗死發(fā)病顯著相關(guān)（OR = 1.23，95%CI：0.96～1.58，P = 0.1）[13]。國(guó)內(nèi)錢明月等的研究亦未證實(shí)MTHFR基因多態(tài)性是腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，病例組和對(duì)照組間MTHFR基因667位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率分布無顯著性差異，提示MTHFR基因667位點(diǎn)可能不是本組人群動(dòng)脈血栓性腦梗死的危險(xiǎn)標(biāo)記。

本研究以動(dòng)脈血栓性腦梗死患者為研究對(duì)象，保證了研究對(duì)象的同質(zhì)性；病例組在起病后一周采血檢測(cè)血漿Hcy水平，避免卒中急性期對(duì)Hcy水平的影響，有效減少研究中的信息偏倚。然而起病后一周的納入標(biāo)準(zhǔn)排除了病情較重短期死亡的患者，可能造成一定的選擇偏倚。

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（收稿日期：2013-04-02）