內(nèi)皮素在子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜增生癥及增殖期子宮內(nèi)膜中的研究

【摘 要】目的：探討內(nèi)皮素（endothelin，ET）在子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)病中的作用。方法：應(yīng)用流式細胞分析技術(shù)（Flow cytometry method，F(xiàn)CM）檢測子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜增生癥及增殖期子宮內(nèi)膜中ET蛋白的相對含量及增殖指數(shù)和凋亡率。結(jié)果：在子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜增生癥及增殖期子宮內(nèi)膜中ET蛋白相對含量分別為（4.40±0.30），（3.99±0.26），（3.48±0.29），增殖指數(shù)分別為（48.74±2.05），（44.41±2.14），（41.57±2.97），凋亡率分別為（17.67±1.76），（14.86±2.09），（11.49±1.90），在子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜增生癥及增殖期子宮內(nèi)膜中三者皆存在顯著性差異（P<0.01）。內(nèi)皮素、凋亡率、增殖指數(shù)三者之間皆呈正相關(guān)（P<0.01）。結(jié)論：ET在子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要促進作用。

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜腺癌； ET；流式細胞分析技術(shù)；

【中圖分類號】R711 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）11—0153—02

【Abstract】Objective： To investigate the role of endothelin（ET）in the development of endometrial adenocarcinoma（EC） .Methods： The protein relative level of ET， the proliferation index and the apoptosis ratio was detected by FCM in endometrial adenocarcinoma（EC）.，hyperplasia of endometrium（HE） and proliferative phase of endonetrium （PE）Samples.Results： In EC， HE and PPE ， the protein relative level of ET are （4.40±0.30），（3.99±0.26）， （3.48±0.29） and the difference is significant （P<0.01）. while those of the proliferation index were （48.74±2.05）， （44.41±2.14） and （41.57±2.97） respectively， those of the the apoptosis ratio were （17.67±1.76）， （14.86±2.09）， （11.49±1.90） ，There was a positive correlation between the the protein relative level of ET and the proliferation index and the apoptosis ratio （ P<0.01）. Conclusion： ET may have a synergistic effect in the genesis and development of EC。

【Key Words】endometrial adenocarcinoma；ET；Flow cytometry method.

子宮內(nèi)膜腺癌在歐美等國家占女性生殖道惡性腫瘤的第一位，我國的發(fā)病率近年來也呈上升趨勢。因此對于子宮內(nèi)膜腺癌的研究在當今就顯得尤為迫切和重要。隨著癌基因和抑癌基因等研究成果的進展，對子宮內(nèi)膜腺癌的分子生物學發(fā)病機制的探索逐步深入，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素（endothelin，ET）在腫瘤血管生成中起著重要的作用，本研究旨在增殖期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生癥、子宮內(nèi)膜腺癌中運用流式細胞分析技術(shù)檢測內(nèi)皮素的相對含量及與增殖指數(shù)，凋亡率進行相關(guān)性研究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011 年 7 月～2012 年 12 月在衡水市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜腺癌54例（均經(jīng)病理證實），年齡 26-66 歲，中位數(shù)年齡 55 歲。術(shù)前均未接受化療、放療及性激素類藥物治療。同時選擇門診手術(shù)室獲得的臨床資料齊全的診刮標本，其中21例子宮內(nèi)膜增生癥，12例增殖期子宮內(nèi)膜作為對照。

1.2 實驗試劑 兔抗人 ET抗體（武漢博士德有限公司）。

1.3 流式細胞分析技術(shù)

1.3.1單細胞懸液樣品的制備：將固定或新鮮的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕搓組織，邊搓邊用生理鹽水沖洗，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)濾除細胞團塊，收集濾下的細胞懸液。以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心沉淀4分鐘，棄去上清液，制成的懸浮液為單分散細胞懸液。

1.3.2 細胞的免疫熒光標記：取單細胞懸液 1×106/ml，分別加入兔抗人ET抗體0.1 ml，室溫孵育 30 分鐘，加入羊抗兔 FITC-IgG二抗工作液 100 μl，避光室溫孵育 30 分鐘，經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾后上機檢測。在對免疫熒光標記物測定時，設(shè)一抗或二抗的本底對照和陰性對照。

1.3.3流式細胞儀檢測條件：采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細胞儀，激發(fā)光源15mW氬離子激光器，激發(fā)波長為488nm，檢測前以flowcheckTMFluorpheres （10 μm）熒光微球（REF 6605359. Beckman Coulter，Inc. Fullerton，CA 92835）作為標準樣品調(diào)整儀器CV值在2%以內(nèi)。應(yīng)用Expo 32 ADC進行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，用Muticycle AV分析軟件對DNA細胞周期擬合分析。

1.3.4測量資料分析方法：

1.3.4.1 ET蛋白表達定量分析：以熒光強度表示蛋白的相對含量。以熒光指數(shù)（FI）表示他們的相對含量，公式為

2 結(jié)果

2.1三種子宮內(nèi)膜組織中ET及增殖指數(shù)、凋亡率的表達情況及與臨床病理指標的關(guān)系。

在子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜增生癥、增殖期子宮內(nèi)膜中，ET蛋白相對含量分別為（4.40±0.30），（3.99±0.26） 和 （3.48±0.29），三者之間存在顯著性差異 （P<0.01）（Table 1）。 ET蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌中的相對含量：手術(shù)病理分期 I期的ET蛋白相對含量為（4.35 ±0.29），II-III期的ET蛋白相對含量為（4.50±0.29），二者之間無顯著性差異（P>0.05）；子宮肌層浸潤<1/2 病例的ET蛋白相對含量為（4.29±0.23），肌層浸潤≥1/2 者ET蛋白相對含量為（4.62±0.30），兩者之間有顯著性差異（P<0.05）；脈管瘤栓陰性的病例中的ET蛋白相對含量為（4.28±0.21），而脈管瘤栓陽性者為（4.59±0.31），兩者之間存在顯著性差異（P<0.05）；G1級的 ET蛋白相對含量為（4.30±0.24），G2-G3級的ET蛋白相對含量為（4.45± 0.32），兩者間沒有明顯差異（P>0.05）。表明ET蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜增生癥、增殖期子宮內(nèi)膜中的表達依次減弱，在子宮內(nèi)膜腺癌中隨浸潤深度的增加而增強，有脈管瘤栓者要比無脈管瘤栓者ET蛋白表達增強。

增殖指數(shù)在子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜增生癥、增殖期子宮內(nèi)膜中分別為（48.74±2.05），（44.41±2.14），（41.57±2.97），三者之間存在顯著性差異 （P<0.01）（Table 2）。在子宮內(nèi)膜腺癌中的結(jié)果：手術(shù)病理分期 I期的增殖指數(shù)為（48.61±1.93），II-III期的為（49.00±2.31），二者之間無顯著性差異（P>0.05）；子宮肌層浸潤<1/2 病例的增殖指數(shù)（47.67±1.55）明顯低于肌層浸潤≥1/2 者（50.91±0.82），兩者之間有顯著性差異（P<0.05）；脈管瘤栓陰性的病例中增殖指數(shù)（47.67±1.67）明顯低于脈管瘤栓陽性者（50.49±1.26），兩者之間存在顯著性差異（P<0.05）；G1級的增殖指數(shù)為（48.33±1.75），G2-G3級的增殖指數(shù)為（48.98±2.19），兩者間沒有明顯差異（P>0.05）（Table 9）。

凋亡率在子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜增生癥、增殖期子宮內(nèi)膜中分別為（17.67±1.76），（14.86±2.09），（11.49±1.90），三者之間存在顯著性差異（P<0.01）（Table 3）。在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達結(jié)果：手術(shù)病理分期 I期的凋亡率為（17.50±1.81），II-III期為（18.00±1.67），二者之間無顯著性差異（P>0.05）；子宮肌層浸潤<1/2病例的凋亡率（16.86±1.34）明顯低于肌層浸潤≥1/2 者（19.27±1.35），兩者之間有顯著性差異（P<0.05）；脈管瘤栓陰性的病例中凋亡率（16.84±1.35）明顯低于脈管瘤栓陽性者（19.02±1.51），兩者之間存在顯著性差異（P<0.05）；G1級的凋亡率為（17.15±1.24），G2-G3級的凋亡率為（17.95±1.95），兩者間沒有明顯差異（P>0.05）（Table 9）。

2.2 ET、凋亡率與增殖指數(shù)之間的關(guān)系

應(yīng)用Pearson直線相關(guān)分析證實在子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜增生癥、增殖期子宮內(nèi)膜中內(nèi)皮素、凋亡率、增殖指數(shù)三者之間皆呈正相關(guān)（P<0.01）。表明凋亡率與增殖活性在子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜增生癥、增殖期子宮內(nèi)膜中依次降低，在子宮內(nèi)膜腺癌中隨浸潤深度的增加而增高，有脈管瘤栓者要比無脈管瘤栓者增高。

3 討論：

子宮內(nèi)膜腺癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的 20%～30%，而且發(fā)病率逐年增高。而實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移與瘤內(nèi)血管生成密切相關(guān)，在血管生成前期，腫瘤生長緩慢，不會發(fā)生轉(zhuǎn)移；一旦血管生成，腫瘤就會呈指數(shù)增長[1]，并可能發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此抑制腫瘤血管形成成為腫瘤治療的新途徑。本文采用基因蛋白ET分別對增殖期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生癥及子宮內(nèi)膜腺癌進行檢測。

3.1 在三種子宮內(nèi)膜組織中ET的表達情況

ET主要分布在血管內(nèi)皮細胞，具有縮血管作用，還對細胞有生長調(diào)節(jié)作用，刺激細胞DNA的合成，促進細胞增殖，誘導腫瘤血管形成。子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)展過程中其血管生成是由彌漫性促血管生長因子引起，本研究發(fā)現(xiàn)ET在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達（4.40±0.30）明顯高于子宮內(nèi)膜增生癥（3.99±0.26）、增殖期子宮內(nèi)膜（3.48±0.29），其差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且隨著肌層浸潤深度的增加及脈管瘤栓的出現(xiàn) ET陽性率升高。提示ET增多使血管生成增多，從而促進子宮內(nèi)膜腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，進一步表明 ET 在子宮內(nèi)膜腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定作用。證實了 ET可以促進子宮內(nèi)膜腺癌血管形成，而且通過誘導血管形成提高子宮內(nèi)膜腺癌的侵襲能力。子宮內(nèi)膜腺癌中 ET的表達雖然隨著組織分化級別的增加而升高，但是沒有顯著差異，提示即使是分化好的子宮內(nèi)膜腺癌也可能具有侵襲能力。子宮內(nèi)膜腺癌中 ET的表達在不同的手術(shù)病理分期之間也沒有顯著差異，提示 ET與子宮內(nèi)膜腺癌的病灶范圍的擴大沒有明顯關(guān)系。

3.2有關(guān)子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的增殖與凋亡。

子宮內(nèi)膜腺癌細胞的凋亡率與增殖活性均明顯高于子宮內(nèi)膜增生癥、增殖期子宮內(nèi)膜組織，可能與以下解釋有關(guān)：1.腫瘤高速增殖，增殖分裂周期縮短，由凋亡方式去除衰老細胞。2.在腫瘤增殖過程中，可能產(chǎn)生一些分化近似正常的細胞，這些細胞增殖能力下降，通過凋亡清除掉，以維持腫瘤細胞的高增殖率[2]。結(jié)果還顯示子宮內(nèi)膜腺癌中隨子宮肌層浸潤深度的增加及脈管瘤栓的出現(xiàn)凋亡率與增殖活性增高。這說明腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力越強，腫瘤細胞的增殖能力越強，相應(yīng)的凋亡率也越高。

3.3 ET和增殖指數(shù)、凋亡率在子宮內(nèi)膜組織中表達的相關(guān)性。

內(nèi)皮素不僅具有強烈的縮血管作用，而且還是強有絲分裂劑 ，促進細胞增殖。研究顯示，ET-1通過依賴P13-K（磷脂酰肌醇-3-激酶）通路激活抗凋亡信號轉(zhuǎn)導（如Akt），從而啟動旁路生存過程[3]。ET具有細胞生長因子樣效應(yīng)，可促進血管平滑肌細胞增殖，從G0期進入G1期，使該細胞分裂增殖。ET的促細胞增殖作用主要通過細胞核內(nèi)的信息傳遞來實現(xiàn)。ET還可通過影響Na+-K+交換改變細胞內(nèi)的PH值，這正是G0-G1轉(zhuǎn)換、進行細胞有絲分裂的必要反應(yīng)。因此ET具有促細胞增殖的生長因子樣效應(yīng)，在多種細胞內(nèi)刺激DNA合成和促進有絲分裂。蛋白激酶C（PKC）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是內(nèi)皮素受體依賴細胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)劑，在AT-1細胞中有促分裂活性。腫瘤細胞可分泌ET，通過旁分泌與自分泌與腫瘤細胞表面的ET受體結(jié)合，誘導細胞增殖，起到內(nèi)生性生長促進劑的作用[4]。

精確預(yù)測腫瘤的生物學行為有助于患者治療方案的選擇，如能在分子水平為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供預(yù)測、判斷指標，則對腫瘤治療的個體化具有指導意義。由于時間關(guān)系本試驗沒有進行子宮內(nèi)膜腺癌的預(yù)后分析研究，因此對于ET在子宮內(nèi)膜腺癌預(yù)后及復(fù)發(fā)中的作用有待于進一步研究。

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