生物鐘基因Per2在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用價值探討

【摘 要】目的：具體探討生物鐘基因Per2在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用價值。方法：選擇2009年4月至2013年1月間32例于我院行結(jié)直腸癌根治術(shù)患者的手術(shù)切除標本作為樣本，同期選擇32例正常腸道組織作為對照樣本，采用免疫組織化學(xué)方法檢測生物鐘基因Per2蛋白的表達。結(jié)果：切片鏡下顯示腫瘤中較配對的正常腸道組織中Per2蛋白的表達呈明顯增高，在細胞核及細胞漿中均見強陽性。隨Dukes分期的增強，Per2表達陽性表達率及陽性強度呈遞增趨勢，Per2中度及強陽性表達與Dukes分期呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：結(jié)直腸腫瘤存在生長凋亡的晝夜節(jié)律性，生物鐘基因Per2可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。

【關(guān)鍵詞】生物鐘基因；結(jié)直腸癌；Per2蛋白；免疫組織化學(xué)方法；Dukes分期

【中圖分類號】R735 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）11—0148—01

眾所周知，人類、老鼠和其它許多植物、動物都擁有一個內(nèi)在的生物鐘，使得生理、行為和生化的周期節(jié)奏與一天24小時的晝夜循環(huán)相一致。當前研究顯示，生物的晝夜節(jié)律失調(diào)是腫瘤發(fā)生和進展的內(nèi)在因素之一。惡性腫瘤的研究目前發(fā)展到從分子水平和蛋白水平尋找防治新手段【1-2】。眾多數(shù)據(jù)顯示，生物鐘基因per2基因的過表達可以促進腫瘤細胞的凋亡，促使實驗動物體內(nèi)的腫瘤縮小，其過表達還可以對細胞的放射性損傷起到修復(fù)作用，這一發(fā)現(xiàn)對腫瘤的臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義【3-4-5】。本文為此具體綜述與臨床分析了生物鐘基因Per2在腫瘤學(xué)的研究概述與應(yīng)用價值，現(xiàn)分析如下：

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2009年4月至2012年1月間32例于我院行結(jié)直腸癌根治術(shù)患者的手術(shù)切除標本作為樣本。入選標準：所有病例術(shù)前均未行相關(guān)手術(shù)治療或放化療。所有病例經(jīng)術(shù)后病理證實為結(jié)直腸腺癌；患者同意留取標本進行研究。其中男性17例，女性15例；年齡分布于40-79歲，平均61.25±3.21歲，中位年齡61歲；病理組成：隆起型腺癌II級16例，潰瘍型腺癌II級10例，浸潤型腺癌II級6例； Dukes分期：A期10例，B期12例，C期10例。同期選擇32例正常腸道組織作為對照。

1.2 標本采集

在手術(shù)切除標本自大體切斷所有血供后15分鐘內(nèi)，自腫瘤侵犯處腸壁取材作為實驗組，自遠離腫瘤近標本切緣處腸壁取材作為對照組，所取標本立即投入液氮中暫存，后放入-70℃冰箱保存，用作組織RNA的抽提。全部標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟切片用作免疫組織化學(xué)檢驗。

1.3 免疫組織化學(xué)方法檢測

免疫組織化學(xué)檢測采用Envision兩步法，DAB顯色；石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟三次，經(jīng)100%、95%、80%的酒精蒸餾水水化，蒸餾水充分洗凈；0.3%H202甲醇液室溫20分鐘，TBS（0.05M，PH7.6，下同）洗5分鐘×3次；枸櫞酸緩沖液（O.01M，PH6.O）高溫預(yù)熱5分鐘，將脫臘水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中火加熱5分鐘×2次，低火保溫5分鐘后取出微波盒，冷卻至室溫取出玻片，先用蒸餾水洗兩次后用TBS洗5分鐘X3次。5%小牛血清蛋白3TC孵育20分鐘。滴加一抗（兔抗人Per2 1：50），37℃溫箱1小時，TBS洗5分鐘X3次。選擇Envision抗兔工作液，37℃溫箱1小時，TBS洗5分鐘X3次。10mlTBS液中加入4mgDAB，充分混勻，滴加0.5mlH202，室溫下顯色5-lO分鐘，顯微鏡下控制著色濃度。常規(guī)蘇木素復(fù)染細胞核1分鐘，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。

1.4 陽性結(jié)果評分標準

顯微鏡下觀察，在清晰的背景上細胞質(zhì)呈現(xiàn)棕色為陽性，同時采用分數(shù)判斷法，0分為陰性（-），1-4分為弱陽性（+），5-8分為中度陽性（++），9-12分為強陽性（+++）【6】。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 圖像分析

Per2表達情況免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，32例人結(jié)直腸癌組織與相配對的正常腸道組織相比較，Per2蛋白表達量明顯不同，全部切片均顯示腫瘤中較配對的正常腸道組織中Per2蛋白的表達呈明顯增高，在細胞核及細胞漿中均見強陽性。具體見圖1與圖2。

2.2 分數(shù)判斷分析

經(jīng)過具體判斷，在正常組織中Per2蛋白均呈陰性表達或者弱性表達；而結(jié)直腸癌組織中，中度及強陽性表達率高達93.8%（30/32），兩組對比差異明顯（P

3 討論

生物鐘“振蕩器”（相當于鐘表的擒縱器）就是位于細胞核內(nèi)的“生物鐘基因”，更準確地說，就是該基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成過程中的負反饋機制。這個結(jié)論來自對突變體的研究，某些生物體內(nèi)的基因突變會導(dǎo)致生物鐘變長、變短或者紊亂，而且這種改變可以隨著這個基因遺傳給下一代，這一點進一步證明了生物鐘的確和基因有關(guān)。外周生物鐘位于組織細胞內(nèi)，具有與母鐘基本相似的基因種類和振蕩模式，哺乳動物的生物鐘基因最早是在下丘腦視交叉上核中被發(fā)現(xiàn)的。至目前為止，哺乳動物至少有十種調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的基因，其中Per基因是調(diào)節(jié)生物節(jié)律的主要基因。Per基因首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，小鼠和人的Per基因約16kb，含23個外顯子序列，它們的結(jié)構(gòu)具有很強的同源性，并且存在Per1、Per2、Per3亞型。相關(guān)的基礎(chǔ)性研究發(fā)現(xiàn)一種人類Per2基因的突變可以引起FASPS癥狀。這是S662G突變，即662位點處絲氨酸被甘氨酸取代，從而阻止了該位點的磷酸化修飾。同時，研究者發(fā)現(xiàn)在正常小鼠中插入人類的突變基因會讓這些小鼠也起早，印證了人類的FASPS癥狀。形成對比的是，如果在662位點處發(fā)生的突變可以引起磷酸化能力增強的話，PER2的轉(zhuǎn)錄水平會上升，小鼠睡眠的時間也會推遲【8】。而之后的一項動物實驗卻發(fā)現(xiàn)長期暴露于光線可以使小鼠發(fā)生乳腺腫瘤的危險性降低【9】。32例人結(jié)直腸癌組織與相配對的正常腸道組織相比較，Per2蛋白表達量明顯不同，全部切片均顯示腫瘤中較配對的正常腸道組織中Per2蛋白的表達呈明顯增高，在細胞核及細胞漿中均見強陽性。在正常組織中Per2蛋白均呈陰性表達或者弱性表達；而結(jié)直腸癌組織中，中度及強陽性表達率高達93.8%（30/32），兩組對比差異明顯（P

我們知道，腸道腫瘤具有較正常腸道組織改變了的新的生物晝夜節(jié)律性形成。有研究對晚期結(jié)直腸癌患者采用近日節(jié)律性用藥方案與傳統(tǒng)以5-Fu為主的聯(lián)合化療方案相比，客觀有效率可提高2-6倍，中位生存期可提高50%，不良反應(yīng)率降低2-10倍左右。大量臨床研究證實時相化療對多種惡性腫瘤有明確療效，其中應(yīng)用時相化療治療晚期結(jié)直腸癌是目前研究最為廣泛和深入的領(lǐng)域之一【10】。本文結(jié)果顯示，隨不同Dukes分期的增強，Per2表達陽性表達率及陽性強度呈遞增趨勢，Per2中度及強陽性表達與Dukes分期呈正相關(guān)，提示Per2基因參與了結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，可能與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

總之，結(jié)直腸腫瘤存在生長凋亡的晝夜節(jié)律性，生物鐘基因Per2參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。

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