中藥蛇足石杉產(chǎn)石杉?jí)A甲內(nèi)共生真菌的研究進(jìn)展

【摘 要】石杉?jí)A甲是來(lái)自蛇足石杉的高效、高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑，野生蛇足石杉頻臨枯竭，石杉?jí)A甲來(lái)源亦將匱乏。來(lái)自蛇足石杉的內(nèi)生真菌可能是解決石杉?jí)A甲資源的有效途徑，本文綜述了近年產(chǎn)石杉?jí)A甲內(nèi)生真菌的研究進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】蛇足石杉；石杉?jí)A甲；內(nèi)生真菌

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004—7484（2013）11—0089—01

石杉?jí)A甲（Huperzine A）是從中藥蛇足石杉[Huperzia serrata（Thunb.）Trev.]中提取的一種強(qiáng)效的乙酰膽堿酯酶（actylcholin esterase，AchE）抑制劑[1-2]，是目前臨床治療老年性癡呆癥（Alzheimers disease，AD）的最有效藥物。因此蛇足石杉遭到瘋狂采挖，野生資源頻臨枯竭。研究顯示，植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與植物相同成分的代謝產(chǎn)物[3]，石杉?jí)A甲的資源問(wèn)題也在此思路下備受研究者的關(guān)注。本文綜述了近年來(lái)中藥蛇足石杉產(chǎn)石杉?jí)A甲的內(nèi)共生真菌的研究進(jìn)展，旨在為相關(guān)研究與應(yīng)用提供參考。

1 石杉?jí)A甲的來(lái)源

石杉?jí)A甲目前主要從蛇足石杉植株提取獲得。蛇足石杉的組織培養(yǎng)尚未取得成功，分離培養(yǎng)來(lái)自蛇足石杉的內(nèi)共生真菌，在解決石杉?jí)A甲的來(lái)源方面已顯示廣闊前景。

2 內(nèi)共生真菌的分離和培養(yǎng)

內(nèi)共生真菌的分離可以用植株的任何部位。方法是先對(duì)植株進(jìn)行徹底的表面滅菌，然后在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行切割培養(yǎng)[4]，一般使用PDA或MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中可以加入青霉素等抗生素防止細(xì)菌污染[5-6]。外植體表面長(zhǎng)出菌絲后，挑取不同部位的菌絲，接種到培養(yǎng)基上分離純化5次以上，保存，進(jìn)行鑒定分析。

3 內(nèi)共生真菌的形態(tài)鑒定

分離獲得的內(nèi)共生真菌，培養(yǎng)后觀察其菌落、菌絲體和孢子的形態(tài)等特征并進(jìn)行鑒定，參照真菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行鑒定[7]，目前報(bào)道的分自蛇足石杉的共生真菌主要有青霉屬、木霉屬、鐮刀菌屬等十幾個(gè)屬[8]。

4 內(nèi)共生真菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)分離獲得的菌株，除進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，還需進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。方法是先提取真菌基因組DNA，對(duì)真菌ITS-rDNA序列擴(kuò)增，最后測(cè)序分析，這主要用于菌種的分類鑒定以及同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析。汪氏等通過(guò)ITS-rDNA對(duì)從蛇足石杉中分離出127株內(nèi)生真菌的序列分析進(jìn)行，結(jié)果這些內(nèi)生真菌分屬于Penicillium sp.等19個(gè)屬[6]。此外可用PAPD、ISSR技術(shù)進(jìn)行多態(tài)和聚類分析[9]。

5 內(nèi)共生真菌在蛇足石杉植株的分布

內(nèi)共生真菌在蛇足石杉植株中不同部位的分布不同，張氏等從蛇足石杉的不同部位所分離到的內(nèi)生真菌的數(shù)目是莖部最多，葉次之，根最少[8]，這與本課題組的研究結(jié)果及其他學(xué)者的研究報(bào)道一致[10，6]。

6 產(chǎn)石杉?jí)A甲內(nèi)共生真菌菌株的篩選與含量測(cè)定

分離得到的內(nèi)共生真菌能否產(chǎn)石杉?jí)A甲？可通過(guò)對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物的檢測(cè)分析進(jìn)行篩選，方法有經(jīng)典的Ellman法和AChE活性抑制法，劉氏等對(duì)Ellman法進(jìn)行改進(jìn)，建立了高效、微量、快速的乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選方法[11]。此外，還可用薄層層析、質(zhì)譜、高效液相、高效毛細(xì)管電泳等法對(duì)發(fā)酵液中石杉?jí)A甲的含量進(jìn)行測(cè)定。

7 開發(fā)前景廣闊的內(nèi)生真菌菌株

楊氏等從蛇足石杉中分離的交鏈孢霉屬真菌YD-01[12]，周氏等分離的內(nèi)生真菌penicillin chrysogenum Thom SHB[13]，蘇氏等分離的子囊菌亞門炭角菌目SY-02菌株[14]等，經(jīng)過(guò)發(fā)酵均可產(chǎn)石杉?jí)A甲，產(chǎn)量從8.17μg/L～56.84μg/L，顯示出廣闊的開發(fā)前景。

總之，產(chǎn)石杉?jí)A甲內(nèi)共生真菌研究是熱點(diǎn)領(lǐng)域，隨著研究的深入，蛇足石杉產(chǎn)石杉?jí)A甲的內(nèi)生真菌研究必將獲得成功，為人類預(yù)防和治療老年性癡呆癥發(fā)揮巨大作用。

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