海洋膠原肽促進大鼠術后傷口愈合的實驗研究

【摘 要】目的：觀察海洋膠原肽（marine collagen peptides， MCPs）對大鼠術后傷口愈合的影響，以期為術后營養(yǎng)支持提供實驗室依據(jù)。方法：取120只體重為230-250g的SD大鼠，分為5組，每組24只，包括空白對照組和4個MCPs組（分別為0.667g/kg.bw、2.0g/kg.bw、6.0g/kg.bw和12g/kg.bw），空白對照組給予等體積溶劑灌胃，進行背部皮膚深達腹腔的切口手術，分別于術后第3、7、14天處死動物，各時間點8只動物。術后每日觀察傷口的愈合情況，進行HE染色、Masson染色，皮膚切口抗張力強度測定和羥脯氨酸測定。結果：MCPs能夠促進傷口恢復，增強皮膚切口的膠原纖維表達和抗張力強度。結論： MCPs可以通過改善大鼠術后的營養(yǎng)狀況進而促進傷口愈合。

【關鍵詞】海洋膠原肽；營養(yǎng)支持；手術；傷口愈合

【中圖分類號】R719.8 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）11—0071—03

實踐證明，通過對住院病人進行合理正確的營養(yǎng)支持，加強或調整住院病人的營養(yǎng)狀況，將會對病人的常規(guī)藥物、手術治療效果產(chǎn)生積極影響，提高有效治愈率，降低死亡率，延長病人生命同時可以減少住院時間、降低醫(yī)療費用。 然而據(jù)統(tǒng)計，約有20%～40%的住院病人有營養(yǎng)不良，尤其是那些消耗性或慢性病的患者，營養(yǎng)不良的發(fā)生率更高[1、2]。營養(yǎng)不良，特別是蛋白質-能量營養(yǎng)不良對于手術后病人的預后會產(chǎn)生嚴重的不良影響，主要表現(xiàn)為傷口愈合不良，其發(fā)生概率達7%[3]，所以通過合理的術后營養(yǎng)支持來促進傷口愈合一直是在臨床治療中廣為重視的一個問題。本研究擬建立術后營養(yǎng)支持的動物試驗模型，觀察海洋膠原肽（marine collagen peptides， MCPs）對大鼠術后傷口愈合的影響，以期為促進外科手術后傷口愈合的營養(yǎng)支持提供理論依據(jù)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

海洋膠原肽由北京中食海氏生物技術有限公司提供，淡黃色粉末狀，以深海魚的魚皮為主要原料，經(jīng)過清洗勻漿-復合偶聯(lián)酶解-酶失活-脫脂-多級膜分離-滲透精制-濃縮-脫色-造粒干燥等工藝制成。

1.2 實驗動物

健康雄性SPF級SD大鼠，體重230～250克，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，合格證號為SCXK（京）-2006-2008。清潔級動物房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～23℃，濕度50%～60%RH。

1.3 主要儀器和試劑

UV7512GD型紫外可見分光光度計（上海欣益儀器儀表有限公司），離心機（Eppendorf 5840R），XH2B型漩渦混勻器，電子天平，多功能生物信號采集系統(tǒng)。羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物制品工程研究所，其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型建立方法

大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉麻醉后，剃去背部皮膚，常規(guī)皮膚消毒，背部兩側分別切一個2cm長的縱行切口，同時切開肌肉，深達腹腔，然后逐層縫合肌肉和皮膚。整個過程模擬臨床外科手術過程，同時手術當天計為術后第0天（post operation day 0. POD0），以此類推。

1.4.2 實驗動物分組

取120只體重為230-250g的大鼠，隨即分為5組，每組24只，包括空白對照組和4個海洋膠原肽組（分別為0.667g/kg.bw、2.0g/kg.bw 、6.0g/kg.bw和12g/kg.bw，相當于人體推薦劑量的3.3倍、10倍、30倍和60倍），空白對照組給予等體積溶劑灌胃。手術當天開始，每日灌胃。分別于第3、7、14天處死大鼠，每個時間點各8只動物。

1.4.3 傷口愈合觀察

1.4.3.1 肉眼觀察

每日用放大鏡觀察切口變化情況。各組于術后第3天觀察傷口及其周圍組織的創(chuàng)傷反應，第7、14天觀察傷口的恢復情況。術后創(chuàng)傷反應及傷口恢復情況統(tǒng)一按本實驗室自制標準評定。

1.4.3.1.1 傷口及其周圍組織的創(chuàng)傷反應評定：①Ⅰ期反應。傷口有輕度腫脹。②Ⅱ期反應。傷口及周圍組織輕度水腫，皮下有散在淤血斑。③Ⅲ期反應。切口有少量血痂附著，傷口及周圍組織明顯水腫。

1.4.3.1.2 傷口恢復情況評定：①優(yōu)。傷口組織無腫脹，皮膚青紫現(xiàn)象消失。②良。傷口組織輕度腫脹，皮下淤血斑消失，青紫現(xiàn)象逐漸消退。③差。傷口及周圍組織腫脹。

1.4.3.2 切口愈合的組織病理學觀察

各組大鼠分別于術后第3、7、14天于傷口處距切口邊緣約0.5cm取全層皮膚組織。左側傷口所取組織的一半用4%多聚甲醛固定，保存待做石蠟切片及HE、Masson染色，另一半用于抗拉力檢測，右側傷口皮膚用于羥脯氨酸測定和其他指標的檢測。

1.4.3.3膠原纖維染色（Masson染色）

組織切片脫蠟至蒸餾水，蘇木素染色5～10分鐘，鹽酸酒精分化，流水藍化，蒸餾水洗，麗春紅酸性品紅液中染5～8分鐘，蒸餾水，1% 磷鉬酸中染1～3分鐘，直接入苯胺藍液或亮綠液5分鐘，水速洗，置60℃溫箱中烘干，二甲苯透明，封固。結果：膠原纖維綠色，肌纖維、纖維素紅色。

1.4.3.4 切口的抗張強度檢測

術后第7、14天，沿切口垂直方向切取以切口為中線，寬為0. 5cm長為中線雙側各0. 5cm，并包含切口在內(nèi)的皮膚組織，去除皮下脂肪組織，于長方形短邊以絲線縫合作為牽引線，將皮條置于帶有張力感受器的裝置中間，張力感受器另一端連接于多功能生物信號采集系統(tǒng)，采用帶有游標卡尺的微調裝置手動逐漸拉伸皮條，記錄皮條被拉斷時的張力。測微尺測量皮膚的厚度，每平方毫米面積的張力即為切口的抗張強度。

1.4.3.5 羥脯氨酸測定

切取大鼠切口周圍2-3毫米的皮膚用于測定羥脯氨酸，方法依據(jù)南京建成生物工程公司的羥脯氨酸檢測試劑盒進行操作。

1.4.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS軟件進行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（`X±S）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1大鼠術后傷口愈合的肉眼觀察結果

肉眼觀察表現(xiàn)，術后第3天，對照組大鼠傷口多數(shù)有血痂附著，傷口及周圍組織明顯水腫，而海洋膠原肽組大鼠傷口的水腫程度明顯減輕（表1）（圖1）。術后第7（圖2）和14天（圖3），海洋膠原肽組大鼠傷口愈合明顯好于對照組大鼠傷口。海洋膠原肽組大鼠比對照組大鼠傷口提前1-2天愈合，同時發(fā)現(xiàn)6.0g/kg.bw和12g/kg.bw劑量組愈合最佳（表2）

3 討論

手術傷口愈合不良的原因非常復雜，主要有：脂肪液化、無菌性毒性反應、年齡老化、營養(yǎng)不良、用藥不當、局部感染或血液循環(huán)不良等，營養(yǎng)不良和局部感染是手術傷口愈合不良非常重要的原因[4]。本研究首次從營養(yǎng)支持的角度探討海洋膠原肽作為一種腸內(nèi)營養(yǎng)制劑的補充劑對于手術后傷口愈合的影響。

手術所致的創(chuàng)傷及并發(fā)癥或伴發(fā)的感染等使機體處于高代謝狀態(tài)，造成機體相對的營養(yǎng)不足。本實驗室前期結果發(fā)現(xiàn)海洋膠原肽是以鮭魚等深海魚皮為主要原料，采用生物酶解技術生產(chǎn)得到的混合寡肽，由2～6個氨基酸組成，相對分子質量在100～860，具有吸收快、低黏度、水溶性好等特點，而且在體內(nèi)吸收快、利用率高；其作為食物也是人體蛋白質合成的重要來源[5]。手術創(chuàng)傷后腸結構和功能，與代謝狀態(tài)密切相關，早期的腸內(nèi)營養(yǎng)，腸腔內(nèi)營養(yǎng)物質即具有局部的營養(yǎng)作用，可以刺激腸道粘膜上皮細胞的生長，促進胃腸激素的分泌，從而保持腸道粘膜結構和功能的完整性[6]。腸內(nèi)營養(yǎng)可防止腸黏膜萎縮，保護腸屏障；減少腸源性內(nèi)毒素移位，繼而減少了因內(nèi)毒素誘發(fā)的炎性因子和細胞因子的連鎖反應，使組織器官損傷減輕，機體免疫能力得以保護。本實驗室還研究發(fā)現(xiàn)海洋膠原肽具有較強的抗氧化活性，可以清除體內(nèi)的自由基，減少炎癥反應，增強小鼠免疫功能，進而增強抗感染能力[7]。本實驗發(fā)現(xiàn)海洋膠原肽能夠促進術后大鼠傷口愈合，可能與海洋膠原肽能夠改善術后營養(yǎng)不良和抗感染密切相關。

創(chuàng)傷愈合的一個重要過程，是酸性成纖維細胞利用氨基酸原料，合成膠原蛋白，如果其物質基礎氨基酸原料供給不足，必將造成愈合延遲[8、9]。本次實驗和本課題組前期實驗[10]都發(fā)現(xiàn)可通過促進傷口皮膚膠原蛋白的合成，從而促進傷口愈合。從組織病理學結果發(fā)現(xiàn)海洋膠原肽能夠趨化誘導炎癥細胞到傷口處，刺激成纖維細胞增殖和分化，促使細胞合成分泌細胞外基質如膠原等。這也可能是海洋膠原肽促進傷口愈合的機制之一。

通過近幾年來對傷口愈合相關文獻的緊密追蹤，發(fā)現(xiàn)以前對傷口愈合的研究模型主要是采用動物皮膚傷口打孔手術模型和單純的皮膚切口手術模型，這僅僅針對皮膚進行損傷，只能反應皮膚的愈合過程。而在臨床實踐中傷口愈合是一個全身整體的過程，單純的皮膚損傷無法體現(xiàn)臨床手術的全過程。本項目的一大特色是建立深達腹腔的手術模型，該模型可以模擬臨床外科手術的整個過程，國內(nèi)尚屬首次報道，以更加全面的反應手術后患者身體變化的動態(tài)過程。

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