期葉皂苷對大鼠體外培養(yǎng)神經(jīng)元的影響及其與TGF—β1的關(guān)系

【摘 要】目的：探討七葉皂苷對SD大鼠大腦皮質(zhì)體外培養(yǎng)神經(jīng)元生長的影響及其與轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor β1， TGF-β1）的關(guān)系。方法：取新生SD大鼠胚胎大腦皮質(zhì)進(jìn)行神經(jīng)元原代培養(yǎng)，隨機(jī)分為正常組（A組）、對照組（B組）、七葉皂苷組（C組），C組加入20 mg/ml七葉皂苷（生理鹽水稀釋），B組加入等量生理鹽水，A組不作任何處理，各組又分為24 h、48 h亞組。采集各時(shí)間點(diǎn)圖像后采用RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA的表達(dá)。采用MTT檢測細(xì)胞活力。結(jié)果：A、B組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)、胞體面積、突起長度及細(xì)胞活力無明顯差異（P﹥0.05），但A、B組均有隨時(shí)間點(diǎn)延長，四個(gè)指標(biāo)上調(diào)的時(shí)間點(diǎn)（P﹤0.05），C組四個(gè)指標(biāo)均較A、B組升高（P﹤0.05）。RT-PCR：TGF-β1 mRNA在A、B組各時(shí)間點(diǎn)之間無差異（P﹥0.05），C組各時(shí)間點(diǎn)較A、B組上調(diào)（P﹤0.05），但隨時(shí)間延長，組內(nèi)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）. 結(jié)論：七葉皂苷可促進(jìn)SD大鼠腦源性神經(jīng)元的存活、生長，其機(jī)制可能是通過上調(diào)TGF-β1的表達(dá).

【關(guān)鍵詞】七葉皂苷；大鼠；神經(jīng)元；轉(zhuǎn)化生長因子β1

【中圖分類號】R651 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）11—0054—02

中藥是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的瑰寶，在各種臨床治療中起到了極大的作用。研究發(fā)現(xiàn)，七葉皂苷對中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病有治療的作用，本實(shí)驗(yàn)擬通過體外原代培養(yǎng)SD大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元，采用七葉皂苷進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)調(diào)查TGF-β1的變化及變化。

1 材料與方法

1.1 所需的試劑

注射用七葉皂苷鈉（批號：1302014，公司：山東綠葉制藥股份有限公司）。MTT（貨號：11684817910，Roche）。RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、PCR Master Mix Kit（貨號：K1621，F(xiàn)ermentas 公司）。DNA Marker、DNA上樣緩沖液. TRIZOL（Molecular Reseach Center）等，均由大連寶生物公司合成.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及其分組

懷孕SD大鼠購自昆明醫(yī)科大學(xué)動物科，取其胚胎大腦皮質(zhì)，放入D12中，離心，棄上清。加500 ul木瓜蛋白酶和500 ul DNA酶，消化15 min。胎牛血清終止消化，離心5 min。濾網(wǎng)過濾收集液，離心棄上清。換神經(jīng)元培養(yǎng)液，放入包被好的培養(yǎng)板中（24孔板及96孔板），37℃，5%CO2培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×109/L，改加B27無血清培養(yǎng)液（含98%Neurobasal+2%B27+0.5 mmol/L L-谷氨酰胺+0.1 U/L青、鏈霉素）。

1.3 神經(jīng)元生長情況觀察

隨機(jī)抽取5孔，在Leica倒置顯微鏡成像系統(tǒng)20倍鏡下采集圖片，每孔采集左上、右上、中、左下、右下方5個(gè)視野. 計(jì)數(shù)每個(gè)視野中神經(jīng)元數(shù)目。

1.4 MTT法檢測神經(jīng)元生長活力

96孔板每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，用生理鹽水稀釋），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO），對照孔（神經(jīng)元、七葉皂苷、培養(yǎng)液、MTT、DMSO）。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增目的基因

采用TRIZOL消化神經(jīng)元，用TRIZOL試劑盒提取總RNA，1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外線透射分析儀上觀察電泳結(jié)果（結(jié)果未列）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對所測得結(jié)果行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測，組間采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)采用單因素方差分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元生長情況觀察

3 討論

1953年，Merkel等從歐馬栗中得到具有溶血作用的皂苷，即七葉皂苷（escin，aescin），該皂苷由等相對分子質(zhì)量的七葉皂苷元、乙酸、惕各酸、葡萄糖醛酸和2分子葡萄糖構(gòu)成[1]。具有抗?jié)B出、恢復(fù)毛細(xì)血管通透性、消水腫、抑制蛋白質(zhì)透過血管進(jìn)入炎癥區(qū)域、改善血液循環(huán)、增加靜脈張力、促進(jìn)淋巴回流、糾正腦功能失常、抑制胃排空、清除活性氧以及抗腫瘤等作用。本研究只是對TGF-β1基因進(jìn)行了部分的研究，至于其它神經(jīng)生長因子在此過種中所發(fā)揮的作用，有待進(jìn)一步的研究.

參考文獻(xiàn)：

[1] 湛建峰， 牛劍釗， 張啟明， 等. 七葉皂苷化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 中國藥事， 2010， 24（8）： 822-824.