檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的BSL—2 實(shí)驗(yàn)室污染狀況的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

【摘 要】目的：對(duì)BSL-2 實(shí)驗(yàn)室安全性進(jìn)行評(píng)估，討論檢測(cè)生物安全二級(jí)（ BSL-2） 實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌（ MTB） 的污染情況。方法：采集物體表面樣本用物表采樣規(guī)格板和棉拭子。采集MTB 檢驗(yàn)前、中、后的空氣樣本，用FA-2 型撞擊式空氣微生物采樣器，收集于血平板和生理鹽水采樣介質(zhì)。接種改良MTB 液體培養(yǎng)基和羅氏中性培養(yǎng)基培養(yǎng)MTB。結(jié)果：未見分枝桿菌生長(zhǎng)改良羅氏中性培養(yǎng)基，經(jīng)測(cè)序證實(shí)屬于MTB 復(fù)合群和膿腫分枝桿菌的有液體培養(yǎng)基檢出的3例分枝桿菌；MTB 核酸陽(yáng)性有3%的樣本，都屬于進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的2個(gè)BSL-2 實(shí)驗(yàn)室； 樣本平皿菌落量來(lái)自生物安全柜的血平板采樣的達(dá)2 + 或以上有25.7%。結(jié)論：總的來(lái)說(shuō)受檢醫(yī)院BSL-2 實(shí)驗(yàn)室MTB 污染的狀況可控制，但應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)生物安全防護(hù)在進(jìn)行MTB藥敏試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室方面。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌；生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室

【中圖分類號(hào)】R446.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004—7484（2013）11—0051—02

前言

我國(guó)數(shù)居世界第2位在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中，全國(guó)受到了MTB 感染約5.5億人。世界衛(wèi)生組織報(bào)道，2009 年全球新發(fā)結(jié)核患者約900 萬(wàn)，約有170 萬(wàn)人死于結(jié)核病。結(jié)核病已成為全世界因傳染病而死亡的成人主要疾病之一[1]。結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，是當(dāng)今對(duì)人類全球范圍最具有威脅性的疾病之一，是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的傳染性疾病。已經(jīng)成為當(dāng)今結(jié)核病控制所面臨的三大難題的是耐藥、流動(dòng)人口和HIV感染，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)的是獲得性免疫缺乏綜合征—即艾滋病AIDS，而AIDS患者又極易患結(jié)核病，因此，再次成為威脅人類健康的主要傳染病的是結(jié)核病。越來(lái)越受關(guān)注在實(shí)驗(yàn)室生物安全問(wèn)題中，可導(dǎo)致病原體泄露到周圍環(huán)境中造成嚴(yán)重后果或感染實(shí)驗(yàn)室工作人員如果忽視生物安全，全世界生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室共同關(guān)注的問(wèn)題是生物安全。因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全工作具有借鑒意義的是要評(píng)價(jià)發(fā)生實(shí)驗(yàn)室污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，檢測(cè)和監(jiān)測(cè)MTB實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的污染。

1 資料和方法

1.1 資料

選擇本市具有代表性的，具進(jìn)行病原菌培養(yǎng)、結(jié)核病篩查及治療資質(zhì)的17家醫(yī)院的BSL-2 實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室按照標(biāo)準(zhǔn)化操作程序進(jìn)行相關(guān)MTB 操作。

1.2 方法

使用采樣規(guī)格板采樣，用生理鹽水濕潤(rùn)棉簽，每采樣一次用75% 的酒精擦規(guī)格板；將采樣棉簽放入50 mL 離心管中密閉；用FA-2 型撞擊式空氣微生物采樣器，收集懸浮在空氣中的微生物粒子，放在采樣介質(zhì)表面上；采樣流量為27.3 L /min，采樣時(shí)間約為20 min； 采集實(shí)驗(yàn)前后實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、實(shí)驗(yàn)區(qū)、生物安全柜的空氣樣本，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室未分出獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間，進(jìn)行空氣采樣在實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行涂片、離心、接種操作過(guò)程中。分別小心將采樣棉簽上的液體擠出用高壓滅菌后的鑷子； 將平皿中的生理鹽水收集到無(wú)菌50 mL 離心管中，輕輕搖晃使生理鹽水接觸整個(gè)平皿底部。進(jìn)行MTB 培養(yǎng)和核酸檢測(cè)用NALC /NaOH處理后。血平板劃線純化菌落，16S rRNA 鑒定挑選所需鑒定的菌種，觀察菌落生長(zhǎng)情況 2 d 后。添加500 μL 的生理鹽水在1.5 mL EP 管中，挑取單個(gè)純化的菌落至EP 管中，震蕩混勻。放置到95 ℃金屬浴中20 min將EP 管，取上清作為核酸模板。13 000 r /min 離心10 min。

1.3 評(píng)估方法

每3天觀察1次中性羅氏培養(yǎng)基，若有疑似污染，鏡檢并在涂片后進(jìn)行抗酸染色及革蘭染色， 若有疑似MTB 菌落生長(zhǎng)形成，則鏡檢判斷是否為抗酸桿菌，做抗酸染色涂片后。若仍未見有分枝桿菌生長(zhǎng)8 周后，則判定為陰性。每日觀察MGIT-960，儀器紅色指示燈立即閃亮，陽(yáng)性樣本，確定是否為分枝桿菌的是陽(yáng)性培養(yǎng)管取出后直接涂片進(jìn)行抗酸染色； 陰性是儀器綠色指示燈閃亮。

3 討論

人及動(dòng)物結(jié)核病的病原菌是結(jié)核分枝桿菌（TB），發(fā)病率最高的是以人型結(jié)核分枝桿菌，約占百分之九十，接下來(lái)接是牛型，其它分枝桿菌所致感染非常少見。近年來(lái)國(guó)內(nèi)有不少有關(guān)生物安全防護(hù)[2]、生物安全管理、 防護(hù)設(shè)備調(diào)查[3]的實(shí)驗(yàn)室生物安全問(wèn)題發(fā)生，越來(lái)越引起人們的重視。一般涉及 MTB 生物安全的文獻(xiàn)較少，缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，主要為說(shuō)明操作規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。難以避免產(chǎn)生氣溶膠在日常檢測(cè) MTB 的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中， 如痰樣本混勻、離心、開啟培養(yǎng)皿和安瓿，樣本涂片、意外事件如培養(yǎng)物的濺出和潑灑、培養(yǎng)液的傾倒和轉(zhuǎn)移、離心管破碎等都可造成嚴(yán)重污染。主要原因是因?yàn)榇蟛糠謱?shí)驗(yàn)室感染人員在處理臨床樣本和培養(yǎng)物過(guò)程中吸入產(chǎn)生的含病原體的氣溶膠所致。醫(yī)務(wù)人員存在較高的感染風(fēng)險(xiǎn)，在結(jié)核病患者較多活動(dòng)的醫(yī)療衛(wèi)生單位。結(jié)核防治工作人員結(jié)核病發(fā)病水平顯著高于一般人群，因此，對(duì)于預(yù)防實(shí)驗(yàn)室感染具有重要意義的是檢測(cè)和監(jiān)測(cè) MTB 實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的污染，評(píng)價(jià)發(fā)生實(shí)驗(yàn)室感染環(huán)節(jié)。在 BSL- 2 實(shí)驗(yàn)室空氣中采集的大部分實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中存在普通環(huán)境微生物的相當(dāng)量的微生物， 主要為芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬， 這可能會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確，給日常樣本帶來(lái)污染，應(yīng)加強(qiáng)消毒措施。

近年來(lái)在結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌學(xué)方法和免疫學(xué)、分子生物學(xué)方面都取得了許多進(jìn)展，將會(huì)給結(jié)核病臨床診斷提供更快速、特異、敏感的診斷方法，在分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)技術(shù)及快速培養(yǎng)更廣泛的應(yīng)用，以及方法不但完善與改進(jìn)方面?？傊?， 本市 BSL- 2 實(shí)驗(yàn)室 MTB 的污染狀況對(duì)實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境不會(huì)造成污染，總體可控。但應(yīng)加強(qiáng)進(jìn)行 MTB 藥物敏感性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室和日常消毒滅菌工作，應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)生物安全防護(hù)工作。

參考文獻(xiàn)：

[1] World Health Organization. WHO report 2010 globalTB control [EB/OL]. http： / /www. who. int /tb /publications/global_report /2010/en/index. html，2010-10-15 /2011-03-15.

[2] 吳朝陽(yáng)， 譚穗茹， 吳瓊誼. 醫(yī)院檢驗(yàn)科感染性氣溶膠的產(chǎn)生及生物安全防護(hù)[ J].職業(yè)與健康， 2008，24（3）：217.

[3] 陸龍喜，林軍明，顧華. 生物安全實(shí)驗(yàn)室中生物安全柜使用現(xiàn)狀調(diào)查[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志， 2010，27（4）：376- 378.