轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在丹參乙酸鎂調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)血紅素加氧酶—1中的作用

【摘 要】目的：探討轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在丹參乙酸鎂調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)血紅素加氧酶-1（HO-1）的作用。方法：構(gòu)建pRNAT-U6.1/Neo-siNrf2真核表達(dá)載體，并將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，用100 μmol/L丹參乙酸鎂處理細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：將Nrf2沉默后，丹參乙酸鎂誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)的作用明顯減弱。結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子Nrf2參與了丹參乙酸鎂調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)HO-1的蛋白表達(dá)上調(diào)。

【關(guān)鍵詞】丹參乙酸鎂，血紅素加氧酶-1，Nrf2

【中圖分類號(hào)】R965.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004—7484（2013）11—0046—02

氧化應(yīng)激及其介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)在心絞痛的發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色[1]。目前防治冠心病的相當(dāng)一部分抗氧化藥物不具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和增加機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)作用。丹參多酚酸鹽廣泛用于冠心病治療[2]，其主要活性成分為丹參乙酸鎂可通過(guò)上調(diào)體內(nèi)HO-1[3]、超氧化物歧化酶等抗氧化酶的水平或活性而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用，但具體機(jī)制仍不清楚，因此本研究進(jìn)一步探討丹參乙酸鎂調(diào)控細(xì)胞內(nèi)HO-1具體機(jī)制。

1 材料與方法：

1.1 主要藥品及儀器：

大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)，pRNAT-U6.1/Neo Vector（美國(guó)Genescript公司），限制性內(nèi)切酶BamHI，Hind III（博尚生物技術(shù)有限公司），DMEM液體培養(yǎng)基（美國(guó)Invitrogen公司），胎牛血清（杭州四季青公司），HO-1抗體（英國(guó)abcam公司），蛋白抽提試劑盒（碧云天生物工程有限公司），丹參乙酸鎂由綠谷集團(tuán)提供。

1.2 靶向Nrf2真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

從Nrf2基因mRNA序列中，按照shRNA序列的選取原則，選擇一對(duì)靶向Nrf2寡核苷酸shRNA序列，結(jié)構(gòu)如下Nrf2-F：5’-GATCCC19GAGTATGAGCTGGAAAAACTTGA

TATCCGGTTTTTCCAGCTCATACTCTTTTTTCCAAA-3’，Nrf2-R：5’-AGCTTTTGG

AAAAAAGAGTATGAGCTGGAAAAACCGGATATCAAGTTTTTCCAGCTCATACTCGG-3’將上述合成的互補(bǔ)單鏈與雙鏈shRNA連接，得到重組質(zhì)pRNATU6.1/Neo-siNrf2，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，將細(xì)胞涂布于LB固體培養(yǎng)基上平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。每個(gè)平板分別挑取4個(gè)克隆在3 mL液體LB 培養(yǎng)基中，搖床上37 ℃， 230 r /min 培養(yǎng)14 h。取2μL 培養(yǎng)菌液做菌落PCR 鑒定，使用載體通用測(cè)序引物進(jìn)行

PCR，引物序列分別為：5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3' ，5'-CTCTAGATCAA

CCACTTTGT-3'，陽(yáng)性克隆PCR 產(chǎn)物約為338bp，進(jìn)一步測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，測(cè)序結(jié)果與所設(shè)計(jì)序列完全同源的重組子為最終正確的重組質(zhì)粒。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中（含青鏈霉素）37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，選取3-5代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)將siNrf2載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入平滑肌細(xì)胞48h后，用100μmol/L丹參乙酸鎂處理24h，用Western blotting檢測(cè)HO-1蛋白水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用單因素方差分析，對(duì)各組進(jìn)行描述性分析和方差齊性檢驗(yàn)，采用SNK法分析各組間的差異，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1靶向Nrf2基因RNA干擾真核表達(dá)載體的鑒定

如圖1，2所示，測(cè)序結(jié)果證實(shí)合成的69 bp寡核苷酸成功無(wú)突變地插入pRNAT-U6.1/Neo載體中，構(gòu)建質(zhì)粒符合要求。

3 討論

生理狀態(tài)下，機(jī)體為了維持正常的生理狀態(tài)，必須形成一套防御機(jī)制免受過(guò)氧化損傷。Nrf2屬于轉(zhuǎn)錄因子亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員之一，是誘導(dǎo)Ⅱ相酶基因表達(dá)的必需調(diào)節(jié)因子[4]。Ⅱ相酶中HO-1是機(jī)體最重要的內(nèi)源性保護(hù)體系之一，可分催化血紅素釋放出鐵、一氧化碳（CO） 和膽綠素，膽綠素在還原酶的作用下迅速轉(zhuǎn)化為膽紅素，后者是強(qiáng)有力的自由基清除劑。

丹參乙酸鎂可提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、HO-1等多種抗氧化酶活力和水平，從而介導(dǎo)組織細(xì)胞的保護(hù)作用[5]，可促進(jìn)氧化應(yīng)激下Nrf2蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，本研究顯示Nrf2沉默后，丹參乙酸鎂誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)的作用明顯減弱，表明轉(zhuǎn)錄因子Nrf2參與了丹參乙酸鎂調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)HO-1的蛋白表達(dá)上調(diào)，為丹參多酚酸鹽治療冠心病進(jìn)一步提供了理論支持。

參考文獻(xiàn)：

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