順鉑對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響

【摘 要】目的：研究順鉑在體外是否可以選擇性誘導(dǎo)9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小。方法：應(yīng)用不同濃度順鉑分別處理9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞株及原代培養(yǎng)的正常鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以TUNEL檢測(cè)兩種細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化。并用Annexin - v-FITC/PI雙標(biāo)記法上流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：經(jīng)順鉑作用后，TUNEL法觀察到9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生了顯著的凋亡形態(tài)改變，而正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有凋亡改變；運(yùn)用Annexin-V-FITC/PI雙標(biāo)記法在流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，在4μg/ml濃度的順鉑的作用下，正常細(xì)胞的凋亡率要明顯小于9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。結(jié)論：順鉑在體外可顯著抑制9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)，但順鉑對(duì)正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用較弱，提示順鉑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用具有一定的選擇性。

【關(guān)鍵詞】順鉑；9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004—7484（2013）11—0039—02

本實(shí)驗(yàn)在體外研究了順鉑對(duì)9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞的促凋亡作用，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)提示，在治療濃度時(shí)，對(duì)正常神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞影響較小。這為我們臨床應(yīng)用順鉑等化療藥物治療顱內(nèi)膠質(zhì)瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系：大鼠9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞；原代正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（從新生乳鼠腦灰質(zhì)部分培養(yǎng)獲得）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備：DMEM、胎牛血清，胰蛋白酶，Annexin V-FITC Kit，原位末端標(biāo)記檢測(cè)試劑盒。倒置相差顯微鏡，超凈臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱，高速離心機(jī)，流式細(xì)胞儀。

1.3 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)[1，2]：無(wú)菌條件下取新生的Wistar乳鼠的腦組織，胰酶消化成單細(xì)胞，放入孵箱中培養(yǎng)并傳代。

1.4 9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)：用細(xì)胞培養(yǎng)方法常規(guī)的傳代培養(yǎng)。

1.5 TUNEL檢測(cè)凋亡[3] ：9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞按105個(gè).mL-1密度接種于六孔培養(yǎng)板中，加入順鉑（4μg/ml），對(duì)照組不加藥，72h后用4%多聚甲醛固定，0.3 %甲醇H2O2處理。光鏡下觀察，結(jié)果判定：細(xì)胞中有棕黃色顆粒者，為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法：細(xì)胞培養(yǎng)方法同上，給予4μg/ml的順鉑處理，72h后用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌離心。將細(xì)胞懸浮于200μL的PI，避光室溫反應(yīng)15min。加入300μL結(jié)合緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 利用倒置顯微鏡下觀察正常傳代培養(yǎng)的9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞和傳至第四代的原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，如圖 （1）。

2.2 原位末端標(biāo)記法檢測(cè)：經(jīng)順鉑作用的正常神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)棕褐色顆粒（圖2A）9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)棕褐色顆粒（圖2B）。

2.3 Annexin-v-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：如圖3所示，所得結(jié)果經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，經(jīng)在4μg/ml的順鉑處理72小時(shí)后，9L細(xì)胞的凋亡率為（ ）：15.62±0.38；正常神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率為（ ）：2.56±0.25。經(jīng)t檢驗(yàn) t=61.273，P<0.001，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

目前的研究表明：膠質(zhì)瘤發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的44%[4]，其死亡率極高。術(shù)后易復(fù)發(fā)。目前還無(wú)有效地治療手段。找到適合的化療藥物及合理治療濃度是我們所要追求的結(jié)果。順鉑可用于惡性膠質(zhì)瘤化療并可誘導(dǎo)其凋亡。順鉑的誘導(dǎo)凋亡主要使Bax基因表達(dá)增高[5]，因Bax與Bcl-2的比值增大導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)任何誘導(dǎo)凋亡的刺激變?yōu)槊舾?，更易出現(xiàn)凋亡[6]。那么可以最大程度殺傷腫瘤細(xì)胞而最低程度影響正常神經(jīng)細(xì)胞就是本實(shí)驗(yàn)研究所解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)在基礎(chǔ)上研究了順鉑對(duì)質(zhì)瘤細(xì)胞和正常神經(jīng)細(xì)胞的促凋亡作用是否相同。TUNEL形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果可見(jiàn)，順鉑處理后的9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞株發(fā)生明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，而正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡改變少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)Annexin-v-FITC/PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞4μmol/ml順鉑作用72小時(shí)下，凋亡率明顯高于正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明順鉑促凋亡作用具有一定的選擇性。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，順鉑在誘導(dǎo)9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞明顯凋亡的同時(shí)對(duì)正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及促凋亡作用較小，因此可為臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，即應(yīng)用順鉑治療膠質(zhì)瘤時(shí)，在合理有效的治療濃度下可有效殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常腦細(xì)胞影響較小。

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