過氧化氫通過激活氧化應(yīng)激誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡

【摘 要】目的：探討氧化應(yīng)激狀態(tài)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞系MC3T3-E1凋亡中線粒體途徑的作用。方法：采用MTT法檢測不同濃度過氧化氫處理后MC3T3-E1的增殖情況；Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞凋亡；JC-1流式細(xì)胞學(xué)檢測線粒體膜電位；DCFH-DA流式檢測ROS活性。結(jié)果：MC3T3-E1過氧化氫處理后，細(xì)胞增殖明顯抑制呈劑量效應(yīng)關(guān)系，ROS活性和凋亡增加，線粒體膜電位降低。結(jié)論：過氧化氫可以增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，通過激活線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

【中圖分類號】R751 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）11—0030—01

隨著社會(huì)人口的老齡化，骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問題[1]。骨形成和骨吸收在其發(fā)病機(jī)制中起到了重要的作用，而在各種類型的骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程中都伴隨著氧化應(yīng)激水平的升高[2，3]，但是氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的具體機(jī)制還上不明確，本實(shí)驗(yàn)通過對誘導(dǎo)成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激，探尋其在成骨細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞株購自美國培養(yǎng)物保存中心 （ATCC，CRL-2593，USA），α-MEM培養(yǎng)基購于GIBCO公司，胎牛血清購于Hyclone公司，H2O2購于碧云天公司， Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于北京賽寶克公司，DCFH-DA和JC-1熒光探針購于Molecular Probes公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、的α-MEM培養(yǎng)基當(dāng)中。實(shí)驗(yàn)分為五組：正常組，0.4 mM組（過氧化氫終濃度為0.4 mM），0.6 mM組（過氧化氫終濃度為0.6 mM），0.8 mM組（過氧化氫終濃度為0.8 mM），NAC組（0.6 mM的過氧化氫+25 mM的NAC）。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測

采用Annexin V-FITC/PI法檢測。10 μl的Annexin V， 5 μl的PI染液，避光孵育，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，CellQuest? 軟件進(jìn)行分析。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測

細(xì)胞內(nèi)的ROS水平采用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行檢測。30 μM 的DCFH-DA 于37℃孵育1 h。用無血清的α-MEM培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5 線粒體膜電位檢測

細(xì)胞線粒體膜電位采用JC-1熒光探針進(jìn)行檢測。JC-1工作液（300 nM JC-1），37℃孵育30 min后，倒置熒光顯微鏡進(jìn)行檢測，并分析熒光強(qiáng)度。此外，細(xì)胞加藥處理后，常規(guī)消化，JC-1染色后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，并分析JC-1陽性率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用 ±s表示，多組間比較采用ANOVA分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，P<0.05表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡

0.4，0.6，0.8 mM H2O2處理MC3T3-E1 24 h 后可以引起明顯的凋亡（圖1A）。早期相對凋亡率及細(xì)胞總相對死亡率明顯增加（圖1B）（*P<0.05，** P<0.01 vs 正常組），而此作用可以被NAC抑制早期相對凋亡率總相對死亡率明顯降低（圖1B）（##p<0.01 vs 0.6 mM）。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是指單位體積估量減少伴有骨強(qiáng)度的降低，主要與骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡破壞相關(guān)。成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性決定了骨形成水平，從而影響骨量[4]。成骨細(xì)胞的凋亡在骨質(zhì)疏松當(dāng)中起到了重要的作用，成骨細(xì)胞的凋亡增加，導(dǎo)致了成骨細(xì)胞數(shù)量的減少，骨形成水平降低，骨量減少[5]。

氧化應(yīng)激水平在機(jī)體的生理和病理過程中起到了重要的調(diào)節(jié)作用，高水平的氧化應(yīng)激狀態(tài)可以細(xì)胞和機(jī)體一系列的代謝紊亂，直接和間接的降低細(xì)胞和機(jī)體的正常生理活性，并引起相關(guān)的病理改變[6，7]。目前研究表明，幾乎所有類型的骨質(zhì)疏松，包括老年性骨質(zhì)疏松、絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松、糖尿病性骨質(zhì)疏松等患者體內(nèi)ROS水平都明顯高于同齡健康人群[8，9]，表明氧化應(yīng)激水平可能是一個(gè)獨(dú)立的因素引起骨質(zhì)疏松。我們通過使用過氧化氫增加成骨細(xì)胞MC3T3-E1內(nèi)ROS水平造成成骨細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增高，來探究成骨細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的凋亡及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)表明隨著過氧化氫量的增加，成骨細(xì)胞內(nèi)ROS水平增殖升高，并隨氧化水平的增高，細(xì)胞增殖活性明顯下降，而凋亡明顯增加，在使用抗氧化劑NAC后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平降低，細(xì)胞凋亡明顯減輕，表明氧化應(yīng)激水平的升高可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡。

總之，本研究表明，隨著過氧化氫濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，使線粒體膜電位下降，線粒體通透性增加，從而激活線粒體凋亡途徑，引起成骨細(xì)胞凋亡。這為骨質(zhì)疏松的防治提供了理論依據(jù)。

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