自發(fā)性高血壓大鼠高敏C反應蛋白的來源

【摘 要】目的：探討自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）體內(nèi)高敏C反應蛋白（hsCRP）的來源。方法：在SHR高血壓形成過程中，檢測血清hsCRP濃度的動態(tài)變化，并從蛋白和mRNA水平同時檢測主動脈平滑肌和肝臟CRP的表達情況。結果：5周齡后SHR的收縮壓隨著周齡的增加而增加，其血清hsCRP水平和主動脈平滑肌CRP的表達量進行性增高，但其肝臟CRP卻始終為低表達。相關分析顯示，SHR的收縮壓水平和血清hsCRP濃度呈正相關；主動脈平滑肌CRP的表達量與血清hsCRP濃度也呈正相關；但是肝臟CRP的表達量卻與血清hsCRP水平無相關性。結論：SHR高水平的hsCRP主要來源于主動脈平滑肌而不是肝臟。

【關鍵詞】C反應蛋白；高血壓

【中圖分類號】R544.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）11—0020—02

傳統(tǒng)認為C-反應蛋白（C-reactive protein， CRP）是一個非特異性的炎癥標志物，其合成主要在肝臟 [1， 2]。但是隨著研究的進展，人們發(fā)現(xiàn)高血壓等心血管病患者血清高敏C反應蛋白（high sensitive C-reactive protein，hsCRP），即用超敏感的方法所檢測到的低水平CPR，顯著升高 [3， 4]，但其高水平hsCRP的來源還很不清楚。自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat， SHR）從5周齡開始收縮壓即可達150mmHg，成年后最高可達200mmHg以上，適于人類的高血壓病研究。因此本課題利用SHR模型，在高血壓形成過程中研究hsCRP的來源，為高血壓防治提供實驗理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

所采用的實驗方案符合江蘇大學實驗動物管理和使用委員會的規(guī)定。清潔級雄性SHR和Wistar京都種大鼠（WKY）購于中科院上海實驗動物中心，實驗前1周適應性飼養(yǎng)于氣溫22～25℃、明暗交替（各12h）的動物房中，自由進食大鼠飼料，自由飲水。實驗分組：SHR和KWY各分為3周齡組（3W）、5周齡組（5W）、8周齡組（8W）和12周齡組（12W），每組各10只。

1.2 主要試劑

抗體、免疫組化SP試劑盒和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒購于Takara生物工程（大連）有限公司。大鼠CRP引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 血壓測量

應用大鼠無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng)，采用套尾法，在大鼠清醒時測量其收縮壓， 重復3 次，取平均值。

1.4 血清hsCRP的測定

大鼠禁食12小時后斷尾采血0.5ml，4℃下3000r/min離心10min，分離血清，取上清液置EP管-20℃保存。待實驗結束后統(tǒng)一使用ELISA試劑盒，按說明書操作，測量血清hsCRP水平。

1.5 主動脈CRP表達的檢測

大鼠苯巴比妥鈉腹腔注射、放血處死后，迅速小心分離其胸腹部的主動脈和肝右葉，冰生理鹽水洗凈淤血，分別取主動脈弓處0.5cm血管組織和0.5cm*0.5cm*0.5cm肝右葉組織置入10%中性甲醛緩沖液中固定24小時用于免疫組織化學染色，其余血管組織和肝右葉組織置入凍存管中-80℃冰箱保存。

1.5.1 免疫組織化學染色

（1） SP法：對主動脈和肝組織標本分別進行常規(guī)石蠟切片，采用免疫組化SP法檢測主動脈壁CRP的表達情況，按試劑盒說明操作。

（2） 免疫組化結果判定：CRP標記的胞漿呈棕色為陽性結果。免疫組化半定量法記錄其中陽性細胞，得出陽性細胞百分數(shù)。

1.5.2 RT-PCR

在冰塊上用眼科剪小心去除肝右葉和主動脈外層結締組織，并去除血管內(nèi)膜，留取中層平滑肌組織。肝臟和血管平滑肌組織分別加入Trizol進行組織均漿，常規(guī)方法提取組織細胞總RNA后，參照RT-PCR劑盒提供的檢測步驟說明進行操作。每個樣品檢測3次，取平均值。所用大鼠CRP引物序列：上游5’-CATCT GTGCC ACCTG GGAGT C-3’，下游5’-AAGCC ACCGC CATAC GAGTC-3’；擴增片段為153bp（基因庫編碼為NM017096）。以大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）作為內(nèi)對照，引物序列為：上游5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3’，下游5’-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，擴增片段為124bp（基因庫編碼為NM017008）。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，溴化乙錠染色，ImageJ 1.37系統(tǒng)進行圖像分析，得出CRP mRNA與GAPDH mRNA的比值。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用stata 7.0件包進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（ ±s）表示，多樣本比較用單因素方差分析（ANOVA）法，兩兩比較用Scheffe’s法。成組計量資料用t檢驗，兩因素的相關性采用直線相關分析。等級資料采用秩和檢驗，兩因素的相關分析采用Spearman等級相關。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同周齡組大鼠血壓和血清hsCRP的比較，見表1。WKY組3周齡到12周齡大鼠收縮壓為正常水平，血清hsCPR為低濃度，且水平相當（P>0.05）。SHR組3周齡大鼠收縮壓和血清hsCRP水平均不高，與WKY組相當（P>0.05），但從5周齡至12周齡收縮壓和血清hsCRP水平進行性增高，與WKY組比較差異有顯著性（P<0.05）。

2.2 SHR血壓和血清hsCRP的相關性分析，見圖1。3、5、8和12周齡SHR收縮壓和血清hsCRP的散點圖提示有線性相關趨勢。線性相關分析證實收縮壓和血清hsCRP水平具有正相關（P<0.05）。

2.3 SHR主動脈和肝臟CRP的表達水平，見，見圖2和圖3。RT-PCR和免疫組化結果顯示，3至12周齡組SHR隨著收縮壓水平的增高，主動脈平滑肌CRP mRNA及其蛋白的表達量進行性增高，各組兩兩比較均有顯著性差異（P<0.05）。但各組肝臟CRP mRNA均為低表達，且各組表達量相當（P>0.05）。

2.4 SHR主動脈和肝臟CRP的表達與血清hsCRP的的相關性分析，見圖4。3、5、8和12周齡SHR主動脈平滑肌CRP mRNA和血清hsCRP的散點圖和相關分析提示隨著CRP mRNA表達量的增高，血清hsCRP水平逐漸升高，并且兩者為正相關（P<0.05）。免疫組織化學染色檢測主動脈平滑肌CRP也有類似結果（P<0.05）。但是，SHR肝臟CRP mRNA的表達量和血清hsCRP的散點圖提示無線性相關趨勢，Spearman等級相關系數(shù)ρs=0.2276，p=0.1578，提示兩者無相關關系。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，5周齡后SHR的收縮壓隨著周齡的增加而增加，其血清hsCRP水平和主動脈平滑肌CRP的表達量進行性增高，但其肝臟CRP卻始終為低表達。相關分析顯示，其收縮壓水平和血清hsCRP水平呈正相關；主動脈平滑肌CRP的表達量與血清hsCRP水平也呈正相關；但是肝臟CRP的表達量卻與血清hsCRP無相關性。研究結果表明，SHR高水平的hsCRP主要來源于主動脈平滑肌而不是肝臟。

臨床上高血壓病、主動脈瘤等常見心血管病都與慢性炎癥密切相關，白細胞介素-6等炎癥細胞因子及CRP水平在這些患者血清和血管壁組織中都顯著增高[5， 6]。但是對于上述高血壓患者hsCRP是來源于肝臟還是病變血管組織本身還很不清楚。隨著研究的進展，人們發(fā)現(xiàn)很多肝外組織，如神經(jīng)元、動脈粥樣硬化組織等均可表達CRP[7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，動脈瘤模型兔增高的hsCRP主要來源于擴張的動脈瘤體而不是肝臟[8]，與本研究結果類似。

大量的臨床研究也顯示高血壓患者體內(nèi)hsCRP明顯增高，而經(jīng)過降血壓治療后hsCRP可顯著降低[9]。高血壓和動脈瘤患者的一個共同病理生理特點是其動脈血管壁或動脈瘤體壁的機械張力增大，而降血壓治療后其動脈壁的機械張力隨之下降。我們的前期研究還證實，在沒有炎癥刺激的情況下，機械牽拉離體的兔腹主動、人內(nèi)乳動脈和大隱靜脈能誘導血管平滑肌細胞表達CRP[8， 10]，提示高血壓時動脈壁張力的增加可能是其產(chǎn)生hsCRP的重要刺激因子。

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