固腎定喘丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

【摘 要】目的：建立固腎定喘丸中牛膝和牡丹皮的TLC鑒別方法以及補骨脂素和異補骨脂素的含量測定方法。方法：采用TLC鑒別方法鑒別固腎定喘丸中的牛膝和牡丹皮，以及采用HPLC法測定固腎定喘丸中補骨脂素和異補骨脂素的含量。結(jié)果：固腎定喘丸中設(shè)計的牛膝和牡丹皮的TLC鑒別方法陰性均有干擾，不能作為牛膝和牡丹皮的TLC鑒別方法；用HPLC法測得固腎定喘丸中補骨脂素和異補骨脂素的含量應(yīng)分別不少于0.48mg/g和0.45mg/g。結(jié)論：所設(shè)計HPLC法測得固腎定喘丸中補骨脂素和異補骨脂素的含量，亦簡便準(zhǔn)確，又能有效地排除其它未知組分的干擾，因此，可作為固腎定喘丸的質(zhì)量控制指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】牛膝；牡丹皮；補骨脂；TLC法；HPLC法

【中圖分類號】R286.02 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）11—0014—03

1 前言

目前，國內(nèi)對于固腎定喘丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來源于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》，標(biāo)準(zhǔn)中對于固腎定喘丸中的牛膝沒有任何鑒定方法，對牡丹皮和補骨脂也僅有顯微鑒別。為了使固腎定喘丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更為全面，從而更好更準(zhǔn)確地指導(dǎo)質(zhì)檢人員對固腎定喘丸的質(zhì)量檢驗工作，使藥品的質(zhì)量得到更好的保證，參考《中華人民共和國藥典》2005年版及其他相關(guān)文獻(xiàn)資料，對固腎定喘丸中牛膝和牡丹皮的薄層鑒別方法以及對補骨脂素和異補骨脂素采用HPLC法含量測定。

2 儀器與試劑

2.1 儀器

Agilent1200高校液相色譜儀，紫外–分光光度計（HELIOS YT）。

2.2 試劑

乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、三氯甲烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、甲醇 、醋酸、水均為分析純。

3 溶液的制備

3.1 牛膝TLC鑒別溶液的制備

供試品溶液的制備：取固腎定喘丸7.6g，加70%乙醇30ml，鹽酸2ml，加熱濃縮至約5ml，用石油醚20ml振搖提取，殘渣加乙醇1ml使溶解，作為供試品溶液。

對照藥材溶液的制備：取牛膝粉末2g，加70%乙醇20ml，加熱濃縮至約5ml，加水10ml，用石油醚20ml提取，提取液蒸干，殘渣加乙醇2ml使溶解，作為對照品溶液。

對照品溶液的制備：精密稱齊墩果酸對照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作對照品溶液。

牛膝陰性對照溶液的制備：除牛膝之外，取固腎定喘丸各成分按處方比例配制好，稱取7.6g加70%乙醇30ml，鹽酸2ml，濃縮至約5ml，用石油醚20ml振搖提取，提取液揮去石油醚，殘渣加乙醇1ml使溶解，作為空白溶液。

3.2 牡丹皮TLC鑒別溶液的制備

供試品溶液的制備：取固腎健脾丸3.8g，研碎，加乙醚20ml，丙酮2ml使溶解，作為供試品溶液。

對照藥材溶液的制備：取牡丹皮粉末1g，加乙醚10ml，丙酮2ml使溶解，作為對照品溶液。

對照品溶液的制備：精密稱取丹皮酚對照品，加丙酮制成每1ml含5mg的溶液，作對照品溶液。

牡丹皮陰性對照溶液的制備：除牡丹皮之外，取固腎健脾丸各成分按處方比例配制好，稱取3.8g加乙醚20ml，丙酮2ml使溶解，作為空白溶液。

3.3補骨脂素與異補骨脂素含量測定溶液的制備

供試品溶液的制備：取固腎定喘丸研細(xì)，取約1g，加入甲醇25ml，用微孔濾膜（0.45um）濾過，作為作為供試品溶液。

對照品溶液的制備：精密稱取減壓干燥至恒重的補骨脂素對照品。2.5mg，加甲醇溶解，精密量取2 ml，置l0ml量瓶中.加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每lml中含補骨脂素0.05 mg）。

同法取異補骨脂素對照品2.5mg制成對照品溶液（每lml中含異補骨脂素0.05 mg）。

補骨脂陰性對照溶液的制備：除補骨脂之外，取固腎健脾丸各成分按處方比例配制好，取約1g，精密加入甲醇25ml，用微孔濾膜（0.45um）濾過，取續(xù)濾液，作為作為空白溶液。

4 方法與結(jié)果

4.1 牛膝TLC 鑒別試驗

樣品溶液、對照藥材溶液及空白溶液的點樣量均為10ul，對照品溶液的點樣量為5ul。用硅膠G自制板，以三氯甲烷一甲醇（40：1）為展開劑，上行展開，展距5～7cm，取出晾干。噴以磷鉬酸試液，在110℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果與記錄（見圖1-1，圖1-2，圖1-2）

（1）肉桂原料溶液（2）山藥原料溶液（3）金櫻子原料溶液（4）齊墩果酸對照品（5）茯苓原料溶液（6）車前子原料溶液（7）附子原料溶液

結(jié)果：由圖2-1可知，在供試品色譜中，在與牡丹皮對照藥材和丹皮酚對照品相應(yīng)的位置上，均有相應(yīng)的斑點出現(xiàn)，但牡丹皮陰性對照有干擾。并經(jīng)試驗確定其干擾藥材為補骨脂。

4.3 補骨脂素與異補骨脂素含量測定的方法學(xué)考察與結(jié)果

4.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

3.3.1.1 色譜條件

色譜柱為Welch Matenals AQ-C18，5um*4.60mm；流動相為甲醇–醋酸–水（35：4：65），流速為1ml/min，檢測波長為245nm，進(jìn)樣量為10ul。理論板數(shù)按補骨脂素和異補骨脂素峰計算應(yīng)分別不低于5000 （見圖3–3，表3–1）。

3.3.1.2 測定波長的選擇

取補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液，于190～900nm范圍內(nèi)掃描，補骨脂素和異補骨脂素均在246nm波長處有最大吸收，故選用246nm作為檢測波長。

4.3.2 專屬性考察

精密吸取補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液、供試品溶液和補骨脂陰性對照溶液各10ul，分別依法注入Agilent1200高校液相色譜儀（見圖3–1～3）。補骨脂陰性對照溶液在與補骨脂素和異補骨脂素峰相應(yīng)位置上未有保留時間相同的色譜峰，對測定結(jié)果無干擾。

4.3.3 線性關(guān)系考察

4.3.3.1 對照品儲備液的制備

取補骨脂素對照品5.496mg，分別置25ml容量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液（0.21984mg/ml）。

同法取異補骨脂素5.470mg制成儲備液（0.2188mg/ml）。

4.3.3.2 線性試驗

精密量取補骨脂素對照品儲備液（0.220mg/ml）0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10ul，以測得的峰面積為縱坐標(biāo)，以補骨脂素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計算得回歸方程為：y = 61326x – 32.335， r=0.9996，補骨脂素進(jìn)樣量在0.11 ～1.10mg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。（見表3–2，圖3–5）。

4.3.8 含量限度的確定

因《中華人民共和國藥典》2005年版一部“補骨脂”含量測定項下規(guī)定，補骨脂按干燥品計算含補骨脂素（C11H6O3）和異補骨脂素（C11H6O3）的總量不得少于0.70%。根據(jù)處方，固腎定喘丸含補骨脂生藥量為98.67mg/g，即成品含補骨脂素（C11H6O3）和異補骨脂素（C11H6O3）的總量理論上為不得少于0.69mg/g，考慮到藥材的來源以及在生產(chǎn)與成品儲存過程中有損失等因素，因此，將本品的含量限度暫定為在10批樣品含量測定結(jié)果最低值的基礎(chǔ)上下浮20%，即本品含補骨脂素（C11H6O3）不得少于0.48mg/g，含異補骨脂素（C11H6O3）不得少于0.45mg/g。

5 結(jié)論

由以上所進(jìn)行的TLC鑒別試驗可以得出，該固腎定喘丸中牛膝和牡丹皮TLC鑒別方法的設(shè)計方案鑒別結(jié)果不夠理想，陰性有干擾，不可作為鑒別項目列入固腎定喘丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

采用以上HPLC法測定固腎定喘丸中補骨脂素和異補骨脂素的含量，簡便準(zhǔn)確，既能有效地排除其它未知組分的干擾，又能使補骨脂素與結(jié)構(gòu)極為相近的異補骨脂素完全分離 ，可作為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制指標(biāo)。

6 討論

6.1 文獻(xiàn)報導(dǎo)[1，2] 牛膝中齊墩果酸用70%乙醇提取，齊墩果酸的含量最高，說明牛膝中齊墩果酸在70%乙醇溶液中溶解性好，故實驗中提取牛膝中的齊墩果酸用的是70%乙醇提取。

6.2 展開時溫度對丹皮酚的Rf值有影響，但由于色譜較簡單，不影響結(jié)果判斷。另外，丹皮酚易升華揮發(fā)，并且不同樣品含量有差異，以及顯色劑的用量和加熱顯色程度等因素影響，丹皮酚斑點大小及顏色不盡一致[3]。

6.3

6.3.1補骨脂為本方的主藥之一，主要含補骨脂素（psoralen）和異補骨脂（isopsoralen）等有效成分。因此試驗中將這2種成分作為測定指標(biāo)，但因本方藥味多，成分復(fù)雜，干擾較大，文獻(xiàn)報道兩成分同時測定的HPLC方法[4，5，6] 分離欠佳，不適宜本品測定。實驗中經(jīng)對提取溶媒、色譜條件優(yōu)化，最后確定甲醇作為提取溶媒，以甲醇–醋酸–水（35：4：65）作為流動相實現(xiàn)了較好的分離效果。方法簡單、穩(wěn)定、可靠，符合含量測定要求。

6.3.2 曾以醋酸乙酯加熱回流、索氏提取樣品，但所提得的補骨脂素和異補骨脂素均不如甲醇的量多，可能是因為甲醇對樣品的穿透力更強的緣故，故選擇以甲醇為提取溶劑；考察了甲醇超聲提取和回流提取的效果，結(jié)果回流提取液雜質(zhì)較多，在進(jìn)行HPLC分析時基線較高，不能很好地進(jìn)行峰面積積分，而超聲提取不但操作簡便且提取液雜質(zhì)較少，利于液湘分析，故選擇超聲提?。辉趯Τ晻r間的考察中發(fā)現(xiàn)，超聲1h即可將樣品中的補骨脂素和異補骨脂素提取得較為完全，因此，確定樣品的處理方法為甲醇超聲1 h。

6.3.3 采用HPLC法對10個批次的固腎定喘丸中的補骨脂素和異補骨脂素進(jìn)行了含量測定，結(jié)果表明，不同批次的固腎定喘丸中的補骨脂素和異補骨脂素的含量有一定的差異，這主要是因為不同時間采收的補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素含量有差異。

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