綠原酸對Aβ引起的小腦顆粒細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

【摘 要】目的：探討綠原酸對淀粉樣β蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）引起的小腦顆粒細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法：體外培養(yǎng)小腦顆粒細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞，將經(jīng)過10μmol/L Aβ預(yù)處理48h的巨噬細(xì)胞上清液移入神經(jīng)細(xì)胞中，同時加200μmol/L的綠原酸。培養(yǎng)2天后，采用MTT法、western bolt和乳酸脫氫酶檢測試劑盒檢測細(xì)胞活性、微管相關(guān)蛋白-2（microtubule- associated protein-2，MAP-2）表達(dá)水平和乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）漏出量。結(jié)果： 將Aβ預(yù)處理的巨噬細(xì)胞上清液移入到單獨(dú)培養(yǎng)的小腦顆粒細(xì)胞48h后，可使小腦顆粒細(xì)胞活性明顯降低，僅為正常的28.35%，加入綠原酸后，細(xì)胞活性明顯增加達(dá)到正常的75.82%（P<0.01）。而在正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+Aβ組中，小腦顆粒細(xì)胞僅有少許死亡。在加入巨噬細(xì)胞上清液的小腦顆粒細(xì)胞組中，MAP-2表達(dá)量明顯下降，僅為正常培養(yǎng)組的31.23%，加入綠原酸后，MAP-2的表達(dá)量則顯著回升（P<0.01），達(dá)到正常的79.77%。LDH漏出量明顯增加，由402nkat/L增加到3046nkat/L，加入綠原酸后，可以使LDH漏出量明顯下降，只有1285nkat/L。結(jié)論：①Aβ蛋白是通過激活巨噬細(xì)胞，使其釋放毒性物質(zhì)，從而引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷。②綠原酸對Aβ引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

【中圖分類號】R85 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）11—0008—02

引言

阿爾茨海默病是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，最顯著的病理學(xué)特征是在神經(jīng)細(xì)胞之間出現(xiàn)大量與神經(jīng)元退行性病變有關(guān)的老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和明顯的膠質(zhì)細(xì)胞化[1-2]。已有大量相關(guān)的實(shí)驗(yàn)資料表明Aβ觸發(fā)了由小膠質(zhì)細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)，使其釋放炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失和認(rèn)知功能的下降。綠原酸具有抗炎作用，但對Aβ所致的炎癥反應(yīng)是否具有抑制作用報(bào)道較少[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測綠原酸對經(jīng)Aβ預(yù)處理的巨噬細(xì)胞上清液加入培養(yǎng)的小腦顆粒細(xì)胞中，細(xì)胞的活性、MAP-2和LDH漏出量的影響，以探討綠原酸對Aβ引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法：

1.1大乳鼠神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)：出生兩三天的SD大鼠乳鼠，無菌條件下取出小腦，置于培養(yǎng)基中，剔除軟腦膜和血管。剪成約1mm3小塊，加入0.25%的胰酶溶液，消化30min，洗滌3次，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為106，接種于0.1mg/mL多聚賴氨酸處理過夜的蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中。置于37℃孵箱中培養(yǎng)，后換液，加入含終濃度阿糖胞苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以抑制非神經(jīng)細(xì)胞增殖，以后每2天換液1次，第7天開始實(shí)驗(yàn)。

1.2小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠腹腔注射淀粉肉湯0.5mL，7d 后取腹腔巨噬細(xì)胞（錐蟲藍(lán)吞噬實(shí)驗(yàn)顯示99%為巨噬細(xì)胞），單獨(dú)培養(yǎng)接種濃度為106/ml置于37℃孵箱孵箱中培養(yǎng)。接種24h后，向培養(yǎng)基中加入經(jīng)老化處理的Aβ 至終濃度為10μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集上清。

1.3細(xì)胞分組及處理方法：神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分為4組，①正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，②正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+巨噬細(xì)胞上清液；③正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+巨噬細(xì)胞上清液+200μmol/L的綠原酸；④正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+10μmol/L Aβ。

1.4 MTT檢測細(xì)胞活性 在細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS （ph=7.4）配）20ul。繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150ul DMSO，振蕩10 分鐘，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)。

1.5 微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)水平 培養(yǎng)2天后，觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，收集細(xì)胞106，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用western blot 方法檢測微管相關(guān)蛋白-2的表達(dá)。

1.6 乳酸脫氫酶漏出量 留取培養(yǎng)的上清液，在pH值為10時乳酸基質(zhì)在氧化型輔酶I存在的情況下，經(jīng)乳酸脫氫酶催化反應(yīng)生成丙酮酸，后者與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在波長為440nm下比色測定丙酮酸二硝基苯腙含量，推算出乳酸脫氫酶漏出量（具體操作按照試劑盒說明進(jìn)行）。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 ，應(yīng)用SPSS13.5分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性的檢測 在細(xì)胞處理48h后，應(yīng)用MTT檢測與正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞相比，正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+巨噬細(xì)胞上清液組細(xì)胞的活性明顯下降，僅為正常培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的28.35%；說明神經(jīng)細(xì)胞在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清（經(jīng)Aβ活化后）的作用下引起細(xì)胞的大量死亡。而在正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+巨噬細(xì)胞上清液+200μmol/L的綠原酸組，細(xì)胞活性為正常培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的75.82%，說明在加入綠原酸后，能明顯減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。在正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+10μmol/L Aβ組，神經(jīng)細(xì)胞的活性為正常培養(yǎng)細(xì)胞的91.27%，說明在正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中，雖然經(jīng)過了純化處理，但仍存在一定的膠質(zhì)細(xì)胞，在Aβ活化后，引起一定神經(jīng)細(xì)胞死亡。

2.2 微管相關(guān)蛋白-2表達(dá) 在細(xì)胞處理48h后，收集細(xì)胞，應(yīng)用western blot 檢測，從結(jié)果可見，在正常培養(yǎng)的細(xì)胞中，MAP-2明顯的高表達(dá)，但在細(xì)胞中加入經(jīng)Aβ處理的巨噬細(xì)胞上清后，MAP-2的表達(dá)明顯下降，僅為正常組的31.23%（P<0.01）。在加入巨噬細(xì)胞上清的同時加入綠原酸后，MAP-2的表達(dá)升高明顯，達(dá)到79.77%（P<0.01），但與正常比還有一定的差距（P<0.05），而在正常細(xì)胞+Aβ組，MAP-2的表達(dá)僅略有下降（表1，圖1）。

MAP-2在1組中明顯的高表達(dá)，但在2組中下降明顯，在三組，表達(dá)又有顯著的上升，在4組中，僅較1組略低。條帶1：正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞；條帶2：正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+巨噬細(xì)胞上清液；條帶3：正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+巨噬細(xì)胞上清液+200μmol/L的綠原酸；條帶4正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+10μmol/L Aβ

2.3 乳酸脫氫酶檢測 在正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中，乳酸脫氫酶的量只有802nkat/L，但在正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞+巨噬細(xì)胞上清液組中，乳酸脫氫酶漏出量顯著升高，達(dá)到3046 nkat/L，說明神經(jīng)細(xì)胞在加入經(jīng)Aβ誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清液后，大量的神經(jīng)細(xì)胞受損，導(dǎo)致大量的乳酸脫氫酶的漏出，而同時加入綠原酸后，在很大程度上可以減少由巨噬細(xì)胞上清液引起的神經(jīng)細(xì)胞膜的損傷，對神經(jīng)細(xì)胞起到明顯的保護(hù)作用（表2）。

3 討論

阿爾茨海默病是以進(jìn)行性癡呆為主要臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征是大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域出現(xiàn)神經(jīng)元缺失、神經(jīng)炎性斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。阿爾茨海默病造成神經(jīng)元喪失的主要機(jī)制是細(xì)胞凋亡。許多學(xué)者研究表明，Aβ對神經(jīng)細(xì)胞沒有直接毒性作用，在純海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中加入Aβ，并未出現(xiàn)對神經(jīng)細(xì)胞的殺傷作用[4]。作者對此也進(jìn)行了初步研究，單獨(dú)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中加入Aβ，只見少量的神經(jīng)細(xì)胞死亡，而經(jīng)Aβ孵育的巨噬細(xì)胞的上清液能引起大量的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，Aβ通過激活巨噬細(xì)胞，使其釋放一些細(xì)胞因子，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。在單獨(dú)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中也出現(xiàn)少量的細(xì)胞凋亡，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的過程中即使加入阿糖胞苷，以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長，但神經(jīng)細(xì)胞不能達(dá)到完全純化，膠質(zhì)細(xì)胞仍存在一定的活性。因此實(shí)驗(yàn)中采用Aβ預(yù)處理巨噬細(xì)胞，再將上清液加入神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中用以模擬體內(nèi)的生理狀態(tài)。

綠原酸是從中藥杜仲中提取出來的主要活性成分。具有抗炎、抗氧化、抑制氨基酸代謝等藥理作用[5]。它能直接對抗炎癥介質(zhì)的作用，降低炎癥組織中前列腺素E2的釋放量，抑制炎癥滲出，從而抑制隨后產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。有研究報(bào)道，綠原酸的抗炎作用的位點(diǎn)可能是小膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入綠原酸組的乳酸脫氫酶漏出量較Aβ預(yù)處理巨噬細(xì)胞上清組明顯減少，對Aβ引起的神經(jīng)細(xì)胞膜損傷具有保護(hù)作用；MAP-2是細(xì)胞骨架中微管的重要組成成分之一，是神經(jīng)細(xì)胞中的標(biāo)志性微管相關(guān)蛋白，分布于胞體、樹突及軸突中。MAP-2可反映神經(jīng)細(xì)胞的存活狀態(tài)和功能，其變化可代表神經(jīng)細(xì)胞病變。應(yīng)用經(jīng)Aβ預(yù)處理的巨噬細(xì)胞上清可引起神經(jīng)細(xì)胞的微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)明顯減少；但在加入巨噬細(xì)胞上清液的同時加入綠原酸后，小腦顆粒細(xì)胞MAP-2表達(dá)明顯增加，說明綠原酸能夠抑制Aβ引起的神經(jīng)細(xì)胞膜損傷和神經(jīng)細(xì)胞的死亡，對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

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