“小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗”方法的改進與研究

摘 要：連續(xù)3d給小鼠腹腔注射淀粉液，誘導并激活巨噬細胞，使用魚紅細胞為吞噬物，替代細胞實驗教材所用的雞紅細胞、羊紅細胞，探索和改進實驗方法，以便更清晰、有效地觀察小鼠腹腔巨噬細胞對外來異物的吞噬作用。取鼠腹腔液制備涂片并固定，用Giemsa染色法進行染色，顯微觀察巨噬細胞對魚紅細胞的吞噬作用。結果顯示，采用魚紅細胞作為吞噬物，細胞染色清晰，吞噬結果明顯，可清晰顯示大量吞噬魚紅細胞的巨噬細胞，吞噬百分率高，便于實驗觀察和計數(shù)，有助于學生對巨噬細胞吞噬作用的理解和掌握。

關鍵詞：巨噬細胞；魚紅細胞；實驗方法；吞噬

中圖分類號 G642.0 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）23-17-02

高等動物體內的巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞等多具有吞噬功能，均由骨髓干細胞分化而來，是機體非特異性免疫功能的重要組成部分。當病原微生物或其他異物侵入機體時，由于巨噬細胞具有趨化性，便向異物處聚集，巨噬細胞可將之內吞入胞質，形成吞噬泡，然后在胞內與溶酶體融合，將異物消化分解，這在機體非特異性免疫中具有重要意義。靜息的巨噬細胞吞噬功能低下，只有活化狀態(tài)下的巨噬細胞才具有較強的吞噬能力?，F(xiàn)在所用細胞實驗教材[1-4]所編列吞噬實驗大多用雞紅細胞、羊紅細胞、墨水、桿菌[5]、熒光微球等作為吞噬物，本文首次使用魚血細胞作為吞噬物，對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬效果進行了探索和研究，以期避免使用家禽作為實驗材料，并進一步完善了實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 魚血紅細胞稀釋液的制備 從市場上購買鯽魚，用注射器尾靜脈采血，或解剖后從魚血竇或心臟抽取魚血。抽取的魚血，不添加抗凝劑，直接用無血清L15培養(yǎng)基（Gibco，invitrogen Corporation），稀釋10倍。配成10%魚血紅細胞懸液備用。

1.1.2 3%可溶性淀粉溶液的制備 稱取可溶性淀粉3g，溶于100mL生理鹽水中，混勻后121℃高壓滅菌20min備用。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的誘導 在實驗前3d，連續(xù)3d定時給小鼠腹腔注射3%淀粉液。注射部位在腹部中央，持針以45°斜角刺入，注意勿傷及內臟或注入腸內，注射后揉動腹部，分散淀粉粒，并觀察注射后動物狀態(tài)，以免小鼠死亡。

1.2.2 魚紅細胞的注射及腹腔液的收集 實驗時，小鼠腹腔注射10%魚紅細胞懸液1mL，輕按小鼠腹部，使懸液分散。60min后，用頸椎脫臼法處死小鼠。將小鼠腹面朝上，于腹部中央用有齒尖鑷夾起皮膚層，用剪刀剪一環(huán)口，撕開腹部皮膚，充分暴露腹膜。此時，向腹腔注射1mL生理鹽水，并輕揉腹部片刻。隨后用剪刀剪開腹膜成一縱形口，用鑷子將兩邊皮膚夾起來，以防腹腔液流出。把內臟推向一側后，可用不裝針頭的注射器或吸管吸取腹腔液，小心操作，以免腹腔內血管破裂，吸取到小鼠腹腔外周血細胞。

1.2.3 制片及染色方法 取腹腔液滴于潔凈的載玻片上，按血涂片制備法制備細胞涂片?？諝飧稍锖螅d片放入100%甲醇液的固定缸中固定5min。固定后的載片，采用扣染法，即用牙簽架起載片，細胞面朝下反扣在玻板上，用Giemsa染色液（Giemsa原液1份，0.075mol/L磷酸緩沖液9份）染色載片，染色時間為20min。染色完成后，揭起載片，用滴管吸取蒸餾水輕緩沖洗載片，洗去多余的染液。

1.2.4 顯微觀察及吞噬百分率和吞噬指數(shù)的計算 載片空氣干燥后，在OLympus BX41顯微鏡下觀察，用DP70攝像頭進行顯微拍攝，并用IPP5.0軟件進行顯微照片標尺標記。40倍物鏡下已能觀察到游離的魚紅細胞及吞噬魚紅細胞的巨噬細胞。實驗共用小鼠5只，實驗過程中未出現(xiàn)死亡，每只小鼠制備5片涂片。每片隨機觀察數(shù)個視野，記錄100個吞噬細胞的吞噬結果，計算吞噬百分率、吞噬指數(shù)。吞噬百分率（%）=吞噬魚紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的總巨噬細胞數(shù)（吞噬及未吞噬的）×100。吞噬指數(shù)=巨噬細胞中所吞噬的魚紅細胞數(shù)/計數(shù)的總巨噬細胞數(shù)。

2 實驗結果

2.1 巨噬細胞吞噬狀態(tài) 在普通光學顯微鏡下，可清晰觀察到主要的三類細胞，魚紅細胞、未吞噬魚紅細胞的巨噬細胞（圖1中1）及吞噬一個或數(shù)個魚紅細胞的巨噬細胞（圖1中2～4）。鯽魚紅細胞多為長橢圓形，核常位于細胞中部，胞核染為深紫色。巨噬細胞大多呈不規(guī)則形狀，胞體表面不光滑，常有突觸，細胞核較大，呈腎形、圓形或其他不規(guī)則形狀，染為紫紅色。巨噬細胞吞噬魚紅細胞，常能觀察到以下幾種吞噬狀態(tài)：巨噬細胞內魚紅細胞膜仍完整；巨噬細胞內魚紅細胞膜不完整或破裂；巨噬細胞內具有一個或數(shù)個大小不等的魚紅細胞細胞核；還可觀察到巨噬細胞膜凹陷，魚紅細胞緊貼在凹陷處正在被吞噬。圖1顯示激活狀態(tài)的巨噬細胞及多種吞噬魚紅細胞的狀態(tài)。

2.2 吞噬率和吞噬指數(shù) 實驗測得小鼠腹腔巨噬細胞吞噬魚紅細胞的吞噬率為25.0%，吞噬指數(shù)為0.31。與雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)相近[6-7]。

3 討論

小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗是生物科學及醫(yī)學專業(yè)本科層次細胞生物學課程開設的實驗必修項目。近年來，由于禽流感[8]的流行，細胞生物學教學實驗室通過多次試驗、反復摸索和研究“小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗”這一實驗內容，在傳統(tǒng)方法的基礎上不斷改進。主要的改進有以下3個方面：一是采用小鼠實驗前連續(xù)3d定時免疫，有效增加了腹腔內處于激活狀態(tài)的巨噬細胞數(shù)量。二是取魚血紅細胞作為吞噬物，且所取魚血不用添加抗凝劑，直接用不加血清的L15細胞培養(yǎng)液來稀釋血細胞，實驗效果明顯，完全符合實驗要求。三是染色方法的好壞直接關系到對實驗結果的觀察，本實驗應用Giemsa染色扣染法，巨噬細胞及魚紅細胞染色均清晰，細胞的形態(tài)結構更加明顯，能有效地分辨各類細胞的細胞核、細胞漿及吞噬魚紅細胞的各種狀態(tài)。此實驗方法已用于我院本科生實驗教學，師生們普遍認為實驗結果便于學生觀察和計數(shù)，有助于學生對吞噬細胞吞噬作用的理解和掌握，提高教學效果。

綜上所述，采用魚血細胞作為吞噬物，實驗結果明顯，吞噬率及吞噬指數(shù)均高于或接近于雞紅細胞的數(shù)據(jù)，并進一步完善了實驗方法，實驗結果更直觀與清晰。同時巨噬細胞吞噬實驗常用于免疫增強藥物活性的測定，其中以體內法最能反應實際吞噬能力，這一方法常用雞紅細胞來進行測定，是否也可用便于取材的魚紅細胞來測定，值得進一步實驗和探討。

參考文獻

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[8]徐德忠，張揚，王波，等.人感染H7N9禽流感分布異常及其異常起源之可能[J].中華疾病控制雜志，2013，17（8）：645-650.

（責編：施婷婷）