恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)的代謝及其代謝產(chǎn)物消除的研究

摘 要：采用肌注的方式，給藥濃度10mg/kg，并采用液相色譜熒光法檢測，初步研究了恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)的代謝規(guī)律及代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的消除規(guī)律。實驗結果表明：恩諾沙星及環(huán)丙沙星在血漿樣品中的回收率為88.5%～91.3%，在腎、脾、肝、肌肉組織樣品中的回收率為82.1%～87.6%。恩諾沙星、環(huán)丙沙星的最低檢測限均可達到0.01mg/kg。恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)肌注給藥后，血樣中濃度快速升高，2h左右基本達到頂峰，然后再緩慢降低；在腎、脾、肝組織中，9～12 h濃度達到頂峰，其中依次為腎>脾>肝，5d后還有2～4mg/kg的殘留；肌肉組織中較其他組織濃度升高稍緩，在18～24h達到頂峰，但是在29d還有濃度0.05mg/kg左右殘留。肌注給藥后0.5h在樣品血漿中、2h在肌肉組織中就能檢出其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星，且環(huán)丙沙星的濃度在血漿中24h內(nèi)在0.1～0.4mg/kg范圍內(nèi)波動；而在代謝組織腎、脾、肝中環(huán)丙沙星濃度慢慢增加，在12h達到峰值，5d內(nèi)濃度明顯，29d檢測不出；肌肉組織則濃度慢慢增加，5d達到實驗最高濃度0.36mg/kg，29d時檢測不出。

關鍵詞：烏鱧；恩諾沙星；環(huán)丙沙星；代謝

中圖分類號 S9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）23-15-02

恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）為第三代喹諾酮類藥物，是動物專用抗菌藥，廣泛應用于各種動物感染性疾病的預防和治療。恩諾沙星在許多動物體內(nèi)發(fā)生脫乙基反應代謝生成具有活性作用的環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）。恩諾沙星的原藥及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在動物體內(nèi)共同作用，這也是此藥效果優(yōu)于其他同類藥物的最主要的原因之一。但是在《無公害食品漁用藥物使用準則》中已將環(huán)丙沙星明確規(guī)定為禁用漁藥[1]。因此，了解恩諾沙星的代謝規(guī)律及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的消除規(guī)律同樣重要。目前關于恩諾沙星作用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物藥代動力學方面的研究較多，如擬穴青蟹[2]、羅氏沼蝦[3]、歐洲鰻鱺[4]、鯉魚[5]、雜交鱘[6]等，但尚未見關于烏鱧體內(nèi)恩諾沙星代謝規(guī)律及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的消除規(guī)律的報道。本實驗中建立了恩諾沙星及環(huán)丙沙星在烏鱧體內(nèi)的檢測方法，同時研究了恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)的代謝規(guī)律及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的消除規(guī)律，以期為檢測恩諾沙星及環(huán)丙沙星在水產(chǎn)動物體內(nèi)的殘留及在養(yǎng)殖中的合理使用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗魚 實驗用烏鱧來自本單位水產(chǎn)研究所自繁自養(yǎng)的雜交鱧，體重250～300g，實驗前一星期暫養(yǎng)在實驗室玻璃缸中。

1.1.2 儀器設備 Waters e2695高效液相色譜儀（2475熒光檢測器，美國Waters公司）；分散機（IKA T18）；氮吹儀（Organomation N-EVAP- 24）；旋渦混合器（VORTEX Wizard）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipor公司）。

1.1.3 藥品與試劑 甲醇、乙腈為HPLC級。磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、磷酸、三乙胺均為分析純。恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星標準品（德國Dr·Ehrenstorfer公司，純度>98%）。

酸化乙腈：乙腈：（鹽酸+水=1+1）=500∶4；磷酸鹽緩沖液：0.1mol/L NaH2PO4，用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0；0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液：取磷酸3.4mL，加水至1 000mL。用三乙胺調(diào)pH至2.4；固相萃取小柱：Waters Oasis HLB 3mL/60mg。

1.2 方法

1.2.1 給藥方式及取樣 實驗條件下暫養(yǎng)的健康雜交鱧，隨機分組，每組5尾，留取未給藥的作為空白對照。實驗組每尾一次性肌注恩諾沙星10mg/kg體重，分別于給藥后0.5h、1h、2h、4h、6h、9h、12h、18h、24h、5d、29d由心臟取血，肝素抗凝，3 000r×15min離心分離血漿，同時取肌肉、腎、肝臟組織，所有樣品保存于-18℃待測。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 血漿樣品 從冰箱中取出血漿樣品，恢復至液態(tài)，準確稱取2g樣品，加6mL磷酸緩沖液，漩渦混勻，過HLB固相萃取小柱（預先用3mL甲醇活化、5mL水洗）、5mL水洗柱，2mL流動相洗脫（藥物濃度高的血清樣用5mL流動相洗脫），過0.45μm濾膜，上機測定。

1.2.2.2 肝、腎、肌肉樣品 稱取1～5g肝、腎、肌肉樣品，加入15mL酸化乙腈，分散機勻漿1min，加2倍樣品質(zhì)量的無水硫酸鈉，漩渦提取，離心，取上清液。殘渣再用10mL酸化乙腈提取1次。合并上清液，35℃氮氣吹干。準確加入 2.0mL流動相溶解，再分別用5mL正己烷凈化2～3次，下層溶液過0.45μm濾膜，上機測定。

1.2.3 色譜條件及工作曲線 色譜柱：Aglient TC-C18，5μm，4.6mm×250mm；流動相：0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（pH=2.4）：乙腈=85∶15；柱溫：35℃；檢測波長：λex 280nm，λem 450nm；流速：0.8mL/min

工作曲線：取一系列標準混合溶液，在上述色譜條件下檢測藥物含量，作出標準曲線。

2 結果與分析

2.1 檢測方法結果

2.1.1 實驗條件下，恩諾沙星與環(huán)丙沙星的保留時間分別為15.8min、22.1min左右，雜峰和藥物峰分離良好。見圖1空白基質(zhì)加標樣。

2.1.2 線性、回收率、精密度 在0～5μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標準曲線回歸方程分別為（Y藥物濃度，X峰面積）恩諾沙星：Y=1.228 1×104 X -2.337 5×104，相關系數(shù)r=0.999；環(huán)丙沙星Y= Y=2.201 0×104 X-4.850 9×104；相關系數(shù)r=0.999 5。

基質(zhì)添加濃度恩諾沙星與環(huán)丙沙星均為0.1mg/kg，血漿樣品的平均回收率為89.7%。其他組織中回收率為82.1%～87.6%。

2.2 恩諾沙星的代謝 恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)肌注給藥后，血樣中濃度快速升高，2h左右基本達到頂峰7.5mg/kg左右，然后再緩慢降低，18h還有5.1mg/kg左右，到5d僅有0.2mg/kg。在組織代謝中，腎、脾、肝在9～12h濃度達到頂峰，其中濃度腎>脾>肝，代謝到5d時還有2～4mg/kg的殘留，直到29d組織中濃度才<0.1mg/kg。肌肉組織中，開始0.5h濃度較低，然后較其他組織濃度升高稍緩，在18～24h達到頂峰，但是在29d還有濃度0.05mg/kg左右殘留。

2.3 環(huán)丙沙星消除 恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)肌注給藥后0.5h就在樣品血漿中檢出其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星，且環(huán)丙沙星的濃度24h內(nèi)在0.1～0.4mg/kg范圍內(nèi)波動，在2h、6h分別呈現(xiàn)波峰。而代謝組織腎、脾、肝中環(huán)丙沙星濃度慢慢增加，在12h達到峰值，5d內(nèi)濃度明顯，29d檢測不出。肌肉組織中從2h開始有低濃度環(huán)丙沙星檢出，然后濃度慢慢增加，5d達到實驗最高濃度0.36mg/kg，29d時檢測不出。

3 討論

烏鱧一次性肌注給藥10mg/kg后，恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)吸收快，血藥濃度高，維持時間長，在24h內(nèi)維持一個較高的濃度水平。因此在實際生產(chǎn)過程中，如果必須用藥，用藥間隔24h都能起到良好的抑菌效果。

恩諾沙星在烏鱧組織代謝中，腎和脾的頂峰濃度都有高于給藥濃度10mg/kg的情況，表明恩諾沙星主要在這兩個組織中代謝且組織有富集藥物的情況。

實驗結果表明，恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)消除緩慢（尤其是相對低溫條件下，本次試驗是在9～10月份進行，氣溫偏低），29d還未能消除完全。生產(chǎn)中如果用藥，為了安全，休藥期至少1個月。環(huán)丙沙星的檢出及消除規(guī)律表明恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)可以脫去乙基產(chǎn)生活性代謝物環(huán)丙沙星，但代謝率相對較低。環(huán)丙沙星的消除呈不規(guī)則波動，可能原因是：（1）實驗中采樣時間間隔設計不夠細；（2）恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)會不斷地代謝為環(huán)丙沙星，同時環(huán)丙沙星在不斷地進行自身的代謝，魚組織肌肉中環(huán)丙沙星含量是恩諾沙星代謝和環(huán)丙沙星自身代謝的一個平衡[7]。另外本次實驗未考慮溫度等環(huán)境因素及給藥方式對恩諾沙星在烏鱧體內(nèi)的代謝的影響，這些有待于進一步研究。

參考文獻

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[7]徐維海，林黎明，朱校斌.恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物在吉富羅非魚、中國對蝦體內(nèi)的殘留規(guī)律研究[J].水產(chǎn)科學，2004，23（7）：5-8.

（責編：陶學軍）