不同產(chǎn)地山茱萸中4種活性成分含量的HPLC分析

劉艷妮，李慧敏，徐 融，韋春桃，康杰芳

（陜西師范大學藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西 西安 710062）

中藥山茱萸為山茱萸科（Cornaceae）植物山茱萸（Cornus of ficinalis Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉，具有補益肝腎、收澀固脫的功效［1－2］；主產(chǎn)河南、浙江和陜西，四川、安徽和山東也有栽培［3］。山茱萸還具有調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗氧化及抗癌等作用，包含有機酸及其酯類、五環(huán)三萜及其酯類、環(huán)烯醚萜類、鞣質(zhì)、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等活性成分［4－7］，其中，馬錢苷是山茱萸藥材檢測的標準成分［2］，沒食子酸具有抗腫瘤作用［8］，5－羥甲基糠醛（5－HMF，5－h(huán)ydroxymethylfurfural）有保護肝腎、抗氧化等藥理活性［9－10］，原兒茶酸具有抗菌及抗腫瘤作用［11］，因此，這4種成分可作為山茱萸藥材和飲片質(zhì)量控制的指標成分。目前，對山茱萸有效成分含量的測定多集中于少數(shù)成分［12－13］，并不能從整體上反映其內(nèi)在質(zhì)量［14］。

作者采用HPLC－DAD法對來源于不同產(chǎn)地的山茱萸果肉中前述4種活性成分的含量進行測定，以期建立山茱萸有效成分的多組分高效液相檢測方法，為山茱萸藥材質(zhì)量的整體評價提供依據(jù)，也為山茱萸的優(yōu)種選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試鮮果樣品分別采自陜西、浙江、河南和安徽，其中，1至3號樣品于2011年10月16日采自陜西丹鳳日月鎮(zhèn)；4和5號樣品于2011年10月17日采自陜西丹鳳流嶺；6至10號樣品于2011年10月4日采自浙江淳安瑤山鄉(xiāng)；11至14號樣品于2011年10月22日采自河南西峽二郎坪鄉(xiāng)；15號樣品于2011年10月22日采自河南西峽太平鎮(zhèn)；16和17號樣品于2011年10月10日采自安徽歙縣杞梓里鎮(zhèn)；18至20號樣品于2011年10月10日采自安徽歙縣金川鄉(xiāng)。樣品均經(jīng)陜西師范大學生命科學學院植物學教研室鑒定為山茱萸成熟果肉。鮮果肉于50℃烘干、粉碎后過40目篩，于4℃干燥保存。

LC－2010A HT型高效液相色譜儀（日本 SHIMADZU公司）、超純水儀（美國Millipore公司）、Centrifuge5804R冷凍臺式離心機（德國 Eppendorf公司）、FA2004N型電子分析天平（上海天平儀器總廠）和KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；乙腈和甲酸均為色譜純、水為超純水、甲醇為分析純。對照品為沒食子酸（中國藥品生物制品檢定所，批號110831－200302，純度≥90.1％）、5－HMF（中國藥品生物制品檢定所，批號111626－200503，純度≥98％）、原兒茶酸（上海一林生物科技有限公司，批號0424121，純度≥98％）和馬錢苷（成都曼斯特生物科技有限公司，批號 MUST－11052813，純度≥98％）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Phenoemenex C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動相A為體積分數(shù)0.1％甲酸溶液、B為乙腈；梯度洗脫：0～15 min，2％B；15～50 min，4％～16％B；50～57 min，16％～18％B；57～67min，18％～90％B；67～77min，90％～2％B。柱溫30℃；流速1.0 mL·min－1；二極管陣列檢測器，檢測波長分別為240、260、265和280 nm；進樣量10μL。

1.2.2 對照品溶液制備及標準曲線繪制 分別精密稱取馬錢苷、沒食子酸、5－HMF和原兒茶酸對照品1.00mg，加入體積分數(shù)80％甲醇溶解并定容至1 mL，0.22μm微孔濾膜過濾；分別稀釋2、100、1000和20倍后再用0.22μm微孔濾膜過濾，分別獲得0.50 mg·mL－1馬錢苷、0.05 mg·mL－1原兒茶酸、0.01 mg·mL－1沒食子酸和0.001 mg·m L－15－HMF對照品溶液。分別精密吸取馬錢苷對照品溶液1、3、4、5、6和10μL，沒食子酸對照品溶液1、2、4、10、20和40μL，5－HMF對照品溶液1、2、4、8、10和20μL，原兒茶酸對照品溶液1、2、4、6、10和20 μL，按照上述色譜條件依次進樣分析。

以峰面積值為縱坐標y、對照品進樣質(zhì)量為橫坐標x繪制標準曲線。馬錢苷對照品的回歸方程為y=（3.2727×106）x+（2.1486×104）（r=0.9990），線性范圍0.500～5.000μg；沒食子酸對照品的回歸方程為y=（1.5467×107）x+（3.7925×104）（r=0.9994），線性范圍0.010～0.400μg；5－HMF對照品的回歸方程為y=（9.1309×106）x+（3.4545×102）（r=0.9999），線性范圍0.001～0.020μg；原兒茶酸對照品的回歸方程為y=（5.4320×105）x+（2.4671×103）（r=0.9998），線性范圍0.050～1.500μg。

1.2.3 供試樣品溶液制備及色譜分析 精密稱取果肉粉末1.00 g，加入25mL體積分數(shù)80％甲醇，稱量后超聲提?。üβ?00W、頻率40 kHz）45 min，用體積分數(shù)80％甲醇補足減失的質(zhì)量；在室溫下于8000 r·min－1離心8 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液即為供試樣品溶液，按照上述色譜條件進樣分析，進樣量10μL。

1.3 方法學考察

1.3.1 精密度實驗 精密吸取2號供試樣液10μL，按照上述色譜條件連續(xù)進樣6次，馬錢苷、沒食子酸、5－HMF和原兒茶酸峰面積值的RSD值分別為1.57％、1.97％、1.30％和1.93％，表明儀器精密度良好。

1.3.2 重現(xiàn)性實驗 稱取2號樣品粉末6份，每份1.00 g，按上述方法制備供試樣液并按照上述色譜條件進樣測定，馬錢苷、沒食子酸、5－HMF和原兒茶酸峰面積值的RSD值分別為1.33％、1.79％、2.23％和1.89％，表明儀器重現(xiàn)性良好。

1.3.3 穩(wěn)定性實驗 取2號供試樣品溶液，按照上述色譜條件分別于0、2、4、8、12和24 h進樣測定，馬錢苷、原兒茶酸、沒食子酸和5－HMF峰面積值的RSD值分別為0.73％、1.22％、1.15％和1.65％，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.4 加樣回收率實驗 稱取2號樣品粉末6份，每份1.000 g，分別準確加入對照品馬錢苷、沒食子酸、5－HMF和原兒茶酸5.667、0.069、0.014和0.456 mg，按上述方法制備供試樣液并進樣分析，計算加樣回收率。馬錢苷、沒食子酸、5－HMF和原兒茶酸的加樣回收率分別為98.56％、100.93％、101.17％和101.40％，RSD值分別為2.01％、2.76％、1.93％和1.34％。

2 結(jié)果和分析

來源于4個省份7個產(chǎn)地的山茱萸果肉中4種活性成分含量的測定結(jié)果見表1。由表1可見：不同產(chǎn)地樣品中4種成分的含量均有一定差異。總體上看，馬錢苷含量在來源于安徽歙縣的樣品中最高、在來源于浙江淳安縣的樣品中最低；沒食子酸含量在來源于陜西丹鳳縣的樣品中最高、在來源于河南西峽縣的樣品中最低；5－HMF和原兒茶酸含量均在來源于浙江淳安縣的樣品中最高、在來源于河南西峽縣的樣品中最低。另外，即使是來源于同一產(chǎn)地的樣品，其4種成分的含量也有明顯差異，例如18、19和20號樣品均來源于安徽歙縣金川鄉(xiāng)，但20號樣品的馬錢苷含量在20個樣品中最高（7.7624 mg·g－1），而19號樣品的馬錢苷含量在20個樣品中幾乎最低（2.7771 mg·g－1），前者為后者的2.8倍。

由表1還可見：4種成分中，馬錢苷含量最高（2.6329～7.7624 mg·g－1），沒食子酸（0.0273～0.3609 mg·g－1）和原兒茶酸（0.1581～0.8374 mg·g－1）含量居中，5－HMF的含量最低（0.0039～0.0263 mg·g－1）。

3 討論和結(jié)論

由上述測定結(jié)果可以看出：不同產(chǎn)地山茱萸果肉中4種活性成分的含量差異較大，浙江淳安產(chǎn)山茱萸果肉中馬錢苷含量均未達到0.6％［2］的標準，說明產(chǎn)地的環(huán)境因素（包括溫度、濕度、土壤、光照時間和海拔等）對山茱萸果肉中活性成分的含量有較大影響。而同一產(chǎn)地不同個體間同一成分的含量也有較大差異，例如采自浙江淳安的6個樣品沒食子酸含量相差近10倍。因此，在評價及考察山茱萸藥材質(zhì)量時應(yīng)綜合考慮其活性成分含量及產(chǎn)區(qū)等因素。

本研究采用高效液相二極管陣列檢測法（HPLC－DAD），結(jié)合體積分數(shù)0.1％甲酸－乙腈流動相梯度洗脫，在67min內(nèi)實現(xiàn)1次進樣可在不同波長下同時測定4種成分的含量，色譜峰峰形好、分離度較高，能夠準確測定4種活性成分的含量。本方法操作簡單，精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，為山茱萸藥材有效成分的質(zhì)量控制和藥效評價奠定了實驗基礎(chǔ)。

表1 來源于不同產(chǎn)地的山茱萸果肉中4種活性成分的含量（±SD，n=3）Table1 Content of four active components in flesh of Cornus of ficinalis Sieb.et Zucc.from different locations（±SD，n=3）

表1 來源于不同產(chǎn)地的山茱萸果肉中4種活性成分的含量（±SD，n=3）Table1 Content of four active components in flesh of Cornus of ficinalis Sieb.et Zucc.from different locations（±SD，n=3）

1）1－3：采自陜西丹鳳日月鎮(zhèn)Collected from Riyue Town in Danfeng County of Shaanxi Province；4－5：采自陜西丹鳳流嶺 Collected from Liuling in Danfeng County of Shaanxi Province；6－10：采自浙江淳安瑤山鄉(xiāng)Collected from Yaoshan Village in Chun’an County of Zhejiang Province；11－14：采自河南西峽二郎坪鄉(xiāng)Collected from Erlangping Village in Xixia County of He’nan Province；15：采自河南西峽太平鎮(zhèn)Collected from Taiping Town in Xixia County of He’nan Province；16－17：采自安徽歙縣杞梓里鎮(zhèn)Collected from Qizili Town in Shexian County of Anhui Province；18－20：采自安徽歙縣金川鄉(xiāng)Collected from Jinchuan Village in Shexian County of Anhui Province.

樣號1） No. of sample1）含量/mg·g－1 Content馬錢苷 Loganin 沒食子酸 Gallic acid 5-HMF 原兒茶酸 Protocatechuic acid16.8964±0.0512 0.0316±0.0003 0.0091±0.0013 0.2305±0.062325.6666±0.0503 0.0304±0.0002 0.0116±0.0012 0.2784±0.031533.2400±0.0261 0.1025±0.0005 0.0194±0.0006 0.2316±0.002942.6329±0.0364 0.3609±0.0031 0.0085±0.0008 0.6485±0.140453.9356±0.0237 0.2874±0.0052 0.0079±0.0009 0.5572±0.069662.8784±0.0232 0.1127±0.0016 0.0194±0.0007 0.8374±0.016572.9783±0.0733 0.0428±0.0014 0.0245±0.0026 0.6473±0.139482.8480±0.1413 0.0273±0.0025 0.0179±0.0024 0.5097±0.072293.7245±0.0082 0.2985±0.0005 0.0263±0.0005 0.7917±0.020910 4.2709±0.0635 0.1583±0.0036 0.0104±0.0019 0.5125±0.018111 5.5048±0.0329 0.0611±0.0024 0.0065±0.0018 0.4216±0.046312 6.8960±0.0427 0.0623±0.0017 0.0039±0.0007 0.3692±0.063213 4.7630±0.0652 0.0514±0.0019 0.0074±0.0006 0.2575±0.017514 2.9239±0.0301 0.0442±0.0021 0.0082±0.0019 0.2439±0.028715 5.5040±0.0431 0.0373±0.0035 0.0076±0.0007 0.2074±0.002416 6.1432±0.0823 0.0789±0.0003 0.0058±0.0016 0.5072±0.004517 7.1692±0.0594 0.0784±0.0022 0.0055±0.0013 0.3408±0.014518 5.6283±0.0523 0.1659±0.0192 0.0057±0.0018 0.4026±0.001919 2.7771±0.0634 0.0715±0.0021 0.0052±0.0015 0.1581±0.007220 7.7624±0.0602 0.2652±0.0047 0.0074±0.0013 0.2572±0.0095

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