液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定乳及乳制品中的三聚氰胺

劉錦，丁軼聰

（阜陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，安徽阜陽 236000）

三聚氰胺（melamine）是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，學(xué)名三氨三嗪，廣泛用于塑料、造紙、紡織、皮革、電器、涂料、醫(yī)藥等行業(yè)［1］。由于三聚氰胺（含氮量66%）與蛋白質(zhì)（平均含氮量16%）相比含有更高比例的氮原子，所以被造假者利用添加在食品中造成蛋白質(zhì)含量較高的假象［2］。我國在2008年發(fā)布并實(shí)施了《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》國家標(biāo)準(zhǔn)，其中包括液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等3 種檢測方法［3］，其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是采用基質(zhì)匹配的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，而基質(zhì)匹配方法存在以下不足：(1)不同品牌奶粉基質(zhì)各不相同，使用單一品種基質(zhì)容易造成差異并影響檢測結(jié)果；(2)因為實(shí)驗人員操作穩(wěn)定性問題，容易在樣品處理環(huán)節(jié)引入誤差，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。

筆者建立了一種同位素內(nèi)標(biāo)測定方法，既可以運(yùn)用同位素內(nèi)標(biāo)物減少不同樣品基質(zhì)對檢測造成的干擾，又可以避免由于人員操作造成的誤差。運(yùn)用該方法參加并通過了2012 年度國家認(rèn)監(jiān)委組織的“乳粉中三聚氰胺含量測定”能力驗證活動，結(jié)果表明該方法可靈敏、準(zhǔn)確地對乳及乳制品中三聚氰胺進(jìn)行檢測。

1 實(shí)驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 型，配備Agilent在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱，美國安捷倫儀器公司；

質(zhì)譜儀：Agilent 6430 型，配備電噴霧離子源，三重四級桿質(zhì)譜儀，美國安捷倫儀器公司；

氮?dú)獍l(fā)生器：N2LCMS–1 CLAIND 型，意大利Claind 公司；

固相萃取柱：Agilent Polymer SCX Box 型，150 mg，6 mL，美國安捷倫儀器公司；

氮吹儀：N–EVAP Ⅲ型，美國Organomation 公司；

高速離心機(jī)、超聲提取儀、渦旋振蕩器、微量移液器；

高純氮?dú)猓杭兌炔恍∮?9.999%；

甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水：色譜純；

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度不小于99.0%，德國Dr.公司；

13C3–三聚氰胺（13C3–MEL）內(nèi)標(biāo)物質(zhì)：純度不小于99.0%，德國Dr.公司；

實(shí)驗用水：屈臣氏蒸餾水。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Rx-Sil 色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈–水（體積比95∶5，含5 mmol／L 乙酸銨溶液），流速為0.3 mL／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源：ESI；模式：正離子；監(jiān)測：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；正電壓：300 V；霧化氣壓力：275.8 kPa（40 psi）；干燥氣體流速：10 L／min；干燥器溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：4 000 V。

甜蜜素的定性定量離子對、碎裂電壓、碰撞氣能量等參數(shù)見表1。

表1 三聚氰胺監(jiān)測離子及相應(yīng)的碰撞能量

1.4 樣品處理

稱取(1.00±0.01) g 樣品于50 mL 具塞塑料離心管中，加入200 μL 100 ng／mL 內(nèi)標(biāo)工作溶液及3 mL 水，渦旋混勻后加入7 mL 乙腈，渦旋混勻30 s 后超聲提取20 min，再渦旋混勻后以5 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心10 min。依次采用5 mL 甲醇、5 mL 水對固相萃取柱進(jìn)行活化，以1 mL／min 流速將離心管中上清液5 mL 加入萃取柱，棄去流出液，然后用5 mL 水和5 mL 甲醇淋洗小柱，負(fù)壓抽干。用6 mol／L l5%氨化甲醇（甲醇與氨水體積比95∶5）洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，在50℃水浴中吹干，用1 mL 乙腈復(fù)溶混合均勻后，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，待測。

1.5 實(shí)驗方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱取適量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用50%甲醇水溶液配制成1.0 mg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，將標(biāo)準(zhǔn)儲備液再用50%甲醇水溶液稀釋成10 μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間液，再將其用乙腈逐級稀釋并加入適量內(nèi)標(biāo)，配制成三聚氰胺質(zhì)量濃度為1.0，5.0，10.0，50.0，100.0 ng／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（均含內(nèi)標(biāo)10 ng／mL）。

1.5.2 樣品測定

儀器按1.2，1.3 條件穩(wěn)定后，分別取處理后的樣液和系列標(biāo)準(zhǔn)使用液各10 μL 進(jìn)行測定，以面積積分，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流(TIC)譜圖見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件

采用乙腈、甲醇水溶液、乙酸鋅水溶液和亞鐵氰化鉀水溶液沉淀蛋白并提取三聚氰胺進(jìn)行比對試驗。實(shí)驗證明，采用甲醇水溶液提取，回收率很低；采用乙酸鋅水溶液和亞鐵氰化鉀水溶液沉淀蛋白時用量較大，重金屬殘留對色譜柱污染較嚴(yán)重［4］并干擾三聚氰胺的分離；乙腈沉淀效果較好，對檢測基本無干擾，故選用乙腈作為提取劑。同時試驗對比了Waters Oasis MCX 萃取柱和Agilent Polymer SCX Box 萃取柱，結(jié)果無明顯差異，實(shí)驗選擇Agilent Polymer SCX Box 萃取柱。試驗中發(fā)現(xiàn)個別萃取柱含有殘留，建議實(shí)驗前對小柱進(jìn)行預(yù)清洗：活化后的小柱加入5%氨化甲醇淋洗，用負(fù)壓抽干，置于干燥處待用。含有殘留的萃取柱空白試驗譜圖見圖2。

2.2 色譜條件的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)［5–7］方法，三聚氰胺屬于強(qiáng)極性的小分子堿性化合物，可以選用親水相互作用色譜柱進(jìn)行分離。實(shí)驗選用的Agilent Rx-Sil 色譜柱由高純度多孔硅膠微球制成，非常適于強(qiáng)親水化合物用高有機(jī)流動相以反相模式分離。該色譜柱需要較長的平衡時間（2～3 h），否則將出現(xiàn)保留時間不重現(xiàn)的現(xiàn)象。在優(yōu)化色譜條件過程中，分別使用了乙腈–水（體積比80∶20，含5 mmol／L 乙酸銨溶液）、乙腈–水（體積比95∶5，含5 mmol／L 乙酸銨溶液）和甲醇–水（體積比90∶10，含1 mmol／L 乙酸銨溶液）3 種體系的流動相組成，發(fā)現(xiàn)乙腈–水組成能夠得到更好的峰形和響應(yīng)值，同時分析時間最短，因此選擇其作為流動相。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)三聚氰胺的分子結(jié)構(gòu)特征，選擇電噴霧離子源，在正離子模式下，首先選擇全掃描模式找到適合本實(shí)驗所用設(shè)備條件的三聚氰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)物的母離子，然后用子離子掃描模式得到子離子，通過調(diào)整駐留時間、裂解電壓和碰撞氣能量得到較高的靈敏度，確定最佳實(shí)驗條件。實(shí)驗采用13C3–MEL作為內(nèi)標(biāo)物［8］進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以消除乳及乳制品中復(fù)雜的基質(zhì)干擾，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 工作曲線方程與檢出限

實(shí)驗表明，在1.0～100.0 ng／mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，以響應(yīng)信號即峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為y=1.140 255x–0.050 629，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋進(jìn)樣，以響應(yīng)值等于3 倍基線噪聲對應(yīng)的三聚氰胺濃度，計算得檢出限為1.0 μg／kg，比GB／T 22388–2008標(biāo)準(zhǔn)中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法規(guī)定的0.01 mg／kg 的定量限降低了很多。

2.5 回收試驗和精密度試驗

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行回收試驗，兩個質(zhì)量濃度添加水平分別為10，20 ng／mL，加標(biāo)回收試驗結(jié)果見表2。同時用添加水平為10 ng／mL 的樣品重復(fù)測定6 次，測試結(jié)果 分 別 為9.980 1，9.984 4，9.992 3，9.990 4，9.978 2，9.988 9 ng／mL，計算得測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%。準(zhǔn)確度和精密度高于國標(biāo)要求。

表2 內(nèi)標(biāo)法加標(biāo)回收試驗結(jié)果

由表1、表2 可知，采用外標(biāo)法進(jìn)行加標(biāo)試驗，除不加內(nèi)標(biāo)物外，樣品前處理步驟和加標(biāo)量均相同，對10 ng／mL 的樣品重復(fù)測定6 次，測試結(jié)果分別為7.7210，7.9561，7.0013，7.0002，7.2487，7.8864 ng／mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.9%，加標(biāo)回收試驗結(jié)果見表3。

表3 外標(biāo)法加標(biāo)回收試驗結(jié)果

由此可見，采用內(nèi)標(biāo)法檢測得到的測量數(shù)據(jù)的精密度和準(zhǔn)確度均有很大程度提高，測定結(jié)果良好。

2.6 方法在能力驗證中的應(yīng)用

2012 年筆者采用此法參加了山西出入境檢驗檢疫局組織的“奶粉中三聚氰胺和硫氰酸根分析能力驗證”活動（編號為PT01–005），中位值為A 38.72，B 10.175，C 18.85，測試結(jié)果為A 39.84，B 10.95，C 19.41，實(shí)驗室Z值的絕對值|Z|＜2，結(jié)果滿意。

3 結(jié)語

通過使用內(nèi)標(biāo)法降低了試樣的基質(zhì)干擾，減少了人為操作誤差，對三聚氰胺的檢測具有較高靈敏度，且方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，適用于乳及乳制品的分析檢測。不足之處是同位素內(nèi)標(biāo)物價格昂貴，增加了檢測成本，不利于方法的推廣。

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