LC–MS／MS 法測定動物性食品中萬古霉素殘留*

蔣玉平，卞永東，王德祥，湯勇，黃傳國

（鹽城市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇鹽城 224005）

萬古霉素屬于萬古霉素類抗生素，是糖肽類化合物，其藥力較強，在其它抗生素對病菌無效時會被使用，但它有嚴重耳毒性及腎毒性。近年來，由于萬古霉素在畜禽和水產(chǎn)品養(yǎng)殖中的濫用，直接影響了以動物為原料的食品的質(zhì)量安全。隨著動物性食品需求的急劇增長，抗生素類藥物的不合理使用和濫用，以及不遵守休藥期等多種原因所導致的動物性食品中藥物殘留問題不斷增多，對公眾健康的潛在危害日趨嚴重［1］。

目前，國內(nèi)外還沒有制定動物性食品中萬古霉素藥物檢測的方法標準。文獻報道的檢測萬古霉素的方法僅有高效液相色譜法［2］。液相色譜的靈敏度低、定性不準確，而液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可顯著提高檢測的準確度、靈敏度，可提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，具有良好的應用前景。為此筆者建立快速高效檢測萬古霉素的液質(zhì)聯(lián)用方法，該方法具有操作簡單、快速，精密度好，準確度高的優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

串聯(lián)三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀：6410 型，美國安捷倫公司；

氮吹儀：HGC–12A 型，天津市威儀科技發(fā)展有限公司；

去離子水發(fā)生器：Milli Q 型，美國Millipore 公司；

電子天平：CP225D 型，最小分度值0.01 mg，德國賽多利斯公司；

HSE 固相萃取儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；

固相萃取小柱：Oasis HLB 型，顆粒度30μm，美國Waters 公司；

勻漿機：FS–1 型，江蘇金壇市榮華實驗儀器廠；

冷凍臺式高速離心機：美國Thermo 公司；

多功能食品粉碎機：SG250A 型，上海藝華電器廠；

水浴恒溫振蕩器：SHA–C 型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；

萬古霉素標準品：純度不低于96 %，德國Dr.E公司；

甲醇、乙腈：色譜純；

甲酸、乙酸、乙酸銨：優(yōu)級純；

實驗用水為自制超純水。

1.2 儀器分析條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plusC18(100 mm ×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：水(A)– 乙腈(B)；流速：0.4 mL／min；梯度：0～0.5 min 5%B，0.50～2.0 min 5%～30 %B，2.0～2.5 min 30%～90%B，2.5～3.0 min 90%B；后 運 行 時 間(post time)： 5 min；柱 溫：40℃；進樣量：5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：MRM 多重反應檢測；氣體溫度：350℃，氣體流速：10 L／mL；霧化器壓力：310.3 kPa(45 psi);毛細管電壓：3 500 V；定性離子對(m／z)：724.9／99.8，724.9／144；定量離子對(m／z)：724.9／99.8；碎裂電壓：120 V；碰撞能量分別分30 V（m／z：724.9／99.8），6 V（m／z：724.9／144）。

1.3 溶液配制

萬古霉素標準儲備液：1 g／L，精密稱取萬古霉素標準品適量，用甲醇–水（體積比5∶95）配制而成，于–20℃冰箱中保存。

萬古霉素標準溶液：吸取適量萬古霉素標準儲備液，稀釋為10 mg／L 的標準中間溶液。吸取適量標準中間溶液，用與試樣基質(zhì)相應的空白樣品提取液配制成1～500 μg／L 基質(zhì)標準工作溶液，使用前配制。

磷酸鹽緩沖溶液：稱取67.7 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和1.5 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4），用水定容至1 000 mL，配制成0.2 mol／L pH8 的磷酸鹽緩沖液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

準確稱取5 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入磷酸鹽緩沖溶液20 mL，勻漿器中高速勻漿提取2 min，超聲提取10 min，重復提取兩次，合并提取液，以4 000 r／min 離心10 min，濾紙過濾，待凈化。

1.4.2 凈化

使用前將HLB 固相萃取小柱依次過3 mL 甲醇、3 mL 水、3 mL 0.2 mol／L 磷酸鹽緩沖溶液活化，將待凈化上清液全部過柱，棄去濾液，用3 mL磷酸鹽緩沖液、3 mL 水洗滌，最后用5 mL 乙腈洗脫并收集；洗脫液在45℃水浴中氮吹濃縮至近干，用流動相[水–乙腈(體積比為95∶5）]定容至1 mL，旋渦混合后過0.22 μm 濾膜，濾液供HPLC–MS／MS 測定［3］。

2 結(jié)果與討論

2.1 MS／MS 條件優(yōu)化

根據(jù)歐盟EC657［4］指令規(guī)定，對于液–質(zhì)聯(lián)用方法，一個母離子（1.0 識別點）加兩個特征子離子（2×1.5 識別點）可以滿足對一個被分析物4 個識別點的定性確證的要求。表1 列出了萬古霉素的母離子、子離子等主要參數(shù)。

表1 主要質(zhì)譜參數(shù)及色譜保留時間

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

對甲醇和乙腈兩種溶劑作為有機相進行了比較試驗。結(jié)果顯示，乙腈更有利于去溶劑化，且萬古霉素的響應值高，所以選擇乙腈作為流動相中的有機相。

水相分別用水、0.1%甲酸水溶液、5 mmol／L甲酸銨溶液、0.1%甲酸、5 mmol／L 甲酸銨溶液，有機相用乙腈，梯度洗脫。綜合考慮峰形、分離度和響應值，選用水–乙腈為流動相。

2.3 樣品前處理條件

動物性食品基質(zhì)差異比較大，選取牛奶、豬肉作為典型基質(zhì)進行加標試驗。提取方法主要為緩沖液提取、固相萃取凈化后再進樣分析。比較了磷酸鹽緩沖溶液和Na2EDTA–Mcllvaine (0.1 mol／L，pH4.0)緩沖溶液［5］的提取效果。實驗發(fā)現(xiàn)前者能較好地提取出被測組分，且回收率較高，故選擇磷酸鹽緩沖溶液為提取液。

2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

精密稱取萬古霉素標準品適量，用甲醇–水(體積比5∶95)稀釋定容，配制成1 g/L 標準儲備液。依次吸取適量標準儲備液配制成濃度分別為1，10，50，250，500 μg/L 系列標準溶液。

在選定的條件下對上述系列標準溶液進行測定，以目標化合物峰面積（Y）和對應標準溶液的濃度（X）進行線性回歸，得線性回歸方程為Y=947.342 45X–1 549.870 1，相關(guān)系數(shù)r2=0.998，線性范圍為1～500 μg／L。以信噪比S／N＝3 計算方法的檢出限，以S／N＝10 計算方法的定量限，經(jīng)計算得檢出限為2 μg／kg，定量限為7 μg／kg。萬古霉素總離子流圖及其MRM 定量離子提取色譜圖見圖1、圖2。

2.5 回收率、精密度試驗

在牛奶、豬肉基質(zhì)空白樣品中添加10，50，100 μg／mL 3 個水平萬古霉素標準溶液進行加標回收試驗，結(jié)果見表3。由表3 可知，3 個水平加標回收率為84.8%～118.2%，相對標準偏差為2.2%～7.2%。由此可見本方法的精密度和準確度良好。加標樣品中殘留物的特征離子豐度比與標準物的特征離子豐度比之間的偏差在20%以內(nèi)，滿足質(zhì)譜方法的確證要求。

表3 回收率和精密度試驗結(jié)果(n=5)

3 結(jié)語

建立了動物性食品中萬古霉素殘留的液質(zhì)聯(lián)用測定方法。該法重現(xiàn)性良好，操作簡便、結(jié)果準確，能滿足日常分析檢驗的需要，有利于提高動物性食品中抗生素殘留的檢測水平。

［1］ 李俊鎖，邱月明，王超.獸藥殘留分析［M］.上海：上海科學技術(shù)出版社，2003.

［2］ 豐嘉駒，顧嘉欽.高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度［J］.中國臨床藥學雜志，2000(2): 107–108.

［3］ 趙華，卞永東，王德祥，等.液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物性食品中20 種抗生素類藥物殘留［J］.化學分析計量，2011，20(1):20–23.

［4］ Commission of the European Communities. Commission decision of 12 August 2002 implementing council directive 96/23/EC concerningthe performance of analytical methods and the interpretation of results[J]. Official Journal of the European Communities,2002, L221: 8–36.

［5］ GB／T 20755–2006 畜禽肉中九種青霉素類藥物殘留量的測定液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法［M］.