從非變性聚丙烯酰胺凝膠中快速高效回收DNA片段

周頤 王憶平

（北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100871）

在分子生物學(xué)試驗(yàn)中，常常要對通過PCR擴(kuò)增獲得的目的DNA片段進(jìn)行回收和純化，除去非特異性的DNA片段［1］。鑒于瓊脂糖凝膠電泳的分辨率在回收小片段DNA時存在較大的局限性［2，3］，小片段DNA的回收純化往往需要借助于分辨率更高的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或高效液相色譜（HPLC），以滿足分子生物學(xué)中要求較高的試驗(yàn)［4，5］。雖然高效液相色譜是一個強(qiáng)有力的分析工具，但使用其回收DNA耗時長，價(jià)格昂貴且只能單線程操作［6］，而聚丙烯酰胺凝膠電泳由于耗時短，價(jià)格經(jīng)濟(jì)，同時可操作回收多個樣品且易掌握，被廣泛應(yīng)用于小片段DNA的回收純化［7，8］。

針對從聚丙烯酰胺凝膠電泳中回收目的DNA，目前報(bào)道了幾種常用的回收方案（擠壓回收法［9］、凝膠浸泡法［10］、磁珠法［11］等），并且生物公司（Qiagen，OMEGA，Biospin等）也研發(fā)了相應(yīng)的回收試劑盒，但冗繁的操作流程和高昂的費(fèi)用以及時間成本，極大地限制了它們的使用。考慮到從PAGE凝膠中回收DNA的困難，主要在于以C-C鍵聚合的PAGE膠，其分子結(jié)構(gòu)非常緊密，在高溫下又不會像瓊脂糖一樣熔化［12］，而擠壓、凝膠浸泡等方法由于耗時久，膠的破碎度低，限制了DNA的釋放，回收效率差。本試驗(yàn)綜合考慮了以上存在的問題，結(jié)合前人的研究成果［13-15］，探索一種簡單快捷的通過增強(qiáng)PAGE凝膠的破碎度，從非變性聚丙烯酰胺凝膠中最大程度地釋放并回收純化DNA片段的方法，并將回收后的DNA樣本用于后續(xù)的凝膠阻滯試驗(yàn)，旨在驗(yàn)證這種純化方法的實(shí)用性和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

長度在186-200 bp，通過限制性內(nèi)切酶EcoR I，Hind III克隆到pUC18載體上的大腸桿菌merR的一系列啟動子。

Bio-Rad 30%（29∶1）丙烯酰胺儲液，ddH2O，過硫酸銨，TEMED，6×loading buffer（0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯青、40%蔗糖），Trans2K DNA ladder marker，Easy Pfu supermix，無水乙醇或異丙醇，醋酸鈉（pH5.2，3 mol/L），Tiangen瓊脂糖膠回收試劑盒，Roche DIG Gel Shift Kit（2ndGeneration），天恩澤溴化乙錠（EB）清除劑，天恩澤PAGE回收DNA試劑盒，GE Health NanoDrop ND-1000。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增目的片段 使用Bio-Rad PCR儀C1000進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系包括：25 μL全式金2×Easy Pfu supermix，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，質(zhì)粒模板1 μL，50 ng，ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 15 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.2 PAGE膠電泳 6%濃度的非變性PAGE膠的制備參照分子克?。ǖ?版）［1］（不同大小的DNA片段應(yīng)選擇適宜的凝膠濃度）。取10 μL 1%瓊脂糖切膠回收的PCR產(chǎn)物加入2 μL 6×loading buffer（0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，40%蔗糖），混勻上樣。150 V恒壓電泳至二甲苯青接近膠板3/4處停，室溫電泳即可，冰浴效果更佳。

1.2.3 溴化乙錠染色 小心撬開玻璃板，將膠輕輕撥入盛有0.5 μg/mL溴化乙錠的容器中，室溫染色10 min。染色完畢后，用清水小心洗脫非特異性結(jié)合于凝膠上的溴化乙錠。

1.2.4 從PAGE中回收純化DNA片段 在凝膠尚未干燥時，用干凈的手術(shù)刀片將待回收的目的DNA片段小心的切割下來，放入干凈的小號研缽中。若PAGE膠已經(jīng)干燥并卷邊，可將凝膠重新放入裝有雙蒸水的培養(yǎng)皿中，于脫色搖床上搖動約5 min，即可重新獲得平整的凝膠用于切膠回收。將液氮小心的注入盛有目的DNA凝膠的研缽中，待液氮揮發(fā)，用干凈的小號瓷杵，將固化后的凝膠碾成均勻的粉末，加入2倍膠體積的去離子水，用1 mL的移液器，充分吹吸混勻并轉(zhuǎn)移至1.5 mL的eppendorf管中，14 000×g室溫離心10 min。吸取上清至新的1.5 mL eppendorf管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇或70%體積的異丙醇，1/10體積的3 mol/L的醋酸鈉（pH5.2），-20℃靜置20 min，14 000×g離心15 min。棄上清，預(yù)冷70%濃度乙醇漂洗2次（亦可更多次），真空抽干或室溫待乙醇揮發(fā)完全，去離子水溶解即可，如需要去除溴化乙錠，可加入溴化乙錠清除劑處理24 h。

2 結(jié)果

2.1 目的DNA片段的獲取

大腸桿菌merR系列啟動子經(jīng)由PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖回收膠電泳檢測的結(jié)果（圖1）顯示，目的DNA片段（大小在196-200 bp之間）通過PCR得到了有效地?cái)U(kuò)增，并且在1%的瓊脂糖回收膠的分辨率下，除了目的條帶以外，沒有非特異性擴(kuò)增的條帶。

圖1 PCR目的DNA片段1%瓊脂糖電泳圖（回收膠）

2.2 兩種回收目的DNA方法的比較

將圖1中的目的條帶從1%的瓊脂糖回收膠上切下來，使用Tiangen瓊脂糖膠回收試劑盒加以回收，回收產(chǎn)物經(jīng)由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖2）顯示，回收的目的片段為單一DNA條帶。

圖2 瓊脂糖凝膠回收純化DNA的檢測（1%瓊脂糖電泳）

同時將圖2中的樣品（即瓊脂糖切膠回收后的DNA片段），上樣于濃度為6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（圖3）。比較圖2和圖3可以看出，瓊脂糖電泳檢測特異的單一條帶經(jīng)聚丙烯酰胺電泳后出現(xiàn)多條非特異性條帶，這些非特異性條帶可能會影響后續(xù)的凝膠阻滯試驗(yàn)的結(jié)果。

圖3 瓊脂糖凝膠回收純化DNA的檢測（6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）

將圖1中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接用于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著進(jìn)行回收純化，得到圖4的結(jié)果。由圖4中的條帶可見，經(jīng)過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳回收純化后，可以有效地消除非特異性條帶的干擾。

圖4 聚丙烯酰胺凝膠回收純化DNA的檢測（6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）

2.3 兩種方法回收的DNA應(yīng)用在凝膠阻滯試驗(yàn)檢中的效果比較

進(jìn)一步用凝膠阻滯試驗(yàn)檢測不同方法下所回收的DNA片段的特異性情況。將圖2中的啟動子DNA樣品用于凝膠阻滯試驗(yàn)（圖3），檢測啟動子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白CRP之間的相互作用，結(jié)果見圖5。

圖5 瓊脂糖凝膠回收純化DNA用于和CRP蛋白的凝膠阻滯電泳圖

從圖5可以看出，除了最下面的free DNA條帶和最上面的目的阻滯條帶以外，還有多條非特異的阻滯條帶，這是由于不純的DNA與蛋白間的非特異性結(jié)合造成的。而通過聚丙烯酰胺凝膠回收純化的DNA用于同樣的凝膠阻滯試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除了單一目的阻滯帶以外，沒有其他非特異的阻滯帶出現(xiàn)（圖6）。

圖6 聚丙烯酰胺凝膠回收純化DNA用于和CRP蛋白的凝膠阻滯電泳圖

2.4 三種不同方法回收DNA的定量評估

從電泳結(jié)果可以看出，同一DNA樣本，通過PAGE回收純化的DNA在純度和特異性上，顯著高于應(yīng)用瓊脂糖方法回收純化的DNA。與此同時，DNA的回收率也是我們最為關(guān)心的指標(biāo)之一。針對不同方法回收到的DNA得率的評估，在此將圖1中的兩個不同的PCR產(chǎn)物，平均分為一式3份（每份100 μL），通過3種方法加以回收（最后回收到相同溶解體積50 μL）：a. Tiangen瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收；b.天恩澤PAGE回收DNA試劑盒回收（浸泡煮沸法）；c.利用“1.2方法”中PAGE回收，通過NanoDrop儀器來檢測。用于校準(zhǔn)零點(diǎn)的去離子水中也相應(yīng)加入了溴化乙錠清除劑，以保持與回收的DNA樣本中的一致性，結(jié)果見表1。

表1 三種不同方法回收DNA濃度及純度的比較

從表1中可以了解到，將樣品A和樣品B通過3種方法回收后，用PAGE回收試劑盒回收的DNA濃度最低，其次是通過瓊脂糖回收試劑盒回收的DNA，而采用本研究“1.2方法”中回收所獲得的DNA濃度最高，且通過該方法回收的DNA在純度上與兩種回收試劑盒回收獲得的DNA純度相當(dāng)。

3 討論

盡管近年來有許多關(guān)于DNA回收、純化方法的報(bào)道和比較，但基本上這些方法都是基于瓊脂糖凝膠的回收和純化方法的改良，針對從PAGE膠中回收和純化DNA方法的報(bào)道極少［16-18］。由于聚丙烯酰胺凝膠在高溫下不熔，強(qiáng)韌致密的結(jié)構(gòu)又限制了DNA的釋放，煮沸、擠壓、搗碎、浸泡的處理都不甚理想，嚴(yán)重影響了回收效率［12］。就目前報(bào)道的方法來看，有的回收率低，有的操作繁瑣，有的價(jià)格昂貴，因此完善而高效的回收方案亟待探索。本試驗(yàn)在沿用一貫采用的乙醇沉淀DNA方法的基礎(chǔ)上，借助液氮對聚丙烯酰胺凝膠的固化作用，通過研磨固化后的凝膠成粉末，破壞凝膠的結(jié)構(gòu)，最大限度的從凝膠中釋放DNA，從而提高DNA的回收率。與以往報(bào)道的回收DNA片段的方法不同的是：由于不需要反復(fù)擠壓、浸泡PAGE膠，整個試驗(yàn)所需操作時間短，隨即避免了因凝膠長時間浸泡以及煮沸法而導(dǎo)致DNA降解［15］；盡管磁珠法回收DNA效率高，但磁珠價(jià)格昂貴，提高了試驗(yàn)成本［11］，而本方法則沒有耗材依賴性；無需借助組織研磨儀等高級器材［14］，摒棄了對儀器的依賴性。

在定量評估不同方法回收DNA的效率上，本研究的方法相較于另外兩種方法而言，能夠獲得較高的DNA濃度，且維持與試劑盒純化回收的DNA相當(dāng)?shù)募兌?。通過一般PAGE試劑盒回收DNA得率低的原因主要是：搗碎、浸泡、煮沸的方法無法最大限度釋放PAGE膠中的DNA，導(dǎo)致溶解在液相中待回收DNA樣品量降低；用瓊脂糖回收試劑盒回收的DNA，得率高于用PAGE回收試劑盒回收的結(jié)果，但仍低于“1.2方法”中所獲得的DNA，究其原因，是因?yàn)槲街系腄NA在較小洗脫體積時不能最大限度的洗脫下來，仍有部分DNA殘留在洗脫柱上，而如果用較大體積洗脫，固然能獲得最大量的總DNA，卻犧牲了單位體積的DNA濃度，不能達(dá)到試驗(yàn)的要求。

使用本方法回收純化DNA要注意的是：（1）當(dāng)用雙蒸水充分溶解被研磨成粉末中的DNA，并通過離心分離上清和下層膠碎片后，在用移液器吸取上清的過程盡量不要吸入下層碎片，以免影響乙醇沉淀的效果；（2）為了加大上樣量，可以在配膠時使用1.5 mm的梳子，或者將樣品先通過瓊脂糖電泳回收濃縮再上樣聚丙烯酰胺凝膠電泳；（3）切膠用的刀片要干凈，所切條帶要盡量細(xì)；（4）用于研磨的研缽要清洗干凈，避免DNA交叉污染；（5）無水乙醇，醋酸鈉和75%的乙醇都要提前預(yù)冷。由于本試驗(yàn)中所研究的目的DNA長度約有200 bp，而分子生物學(xué)研究中往往要用到更短的DNA片段（< 50 bp），如果通過本方法回收純化這類小片段，首先要選擇合適的丙烯酰胺儲液（丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺混合液，19∶1），同時提高用于電泳的聚丙烯酰胺膠的濃度以加大分辨率，另外在乙醇沉淀的過程中要相應(yīng)地延長冰浴時間和離心時間。對于單鏈寡核苷酸的回收也可參考使用本方法，考慮到用于分離單鏈寡核苷酸的凝膠中含有尿素，因此在最后洗滌的時候要相應(yīng)多洗滌兩次以除去尿素。

4 結(jié)論

通過研磨固化的凝膠以最大限度釋放凝膠中的DNA，從而快速高效地從非變形聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段的方法。通過不同試驗(yàn)手段檢測，該方法回收純化的DNA特異性強(qiáng)，得率高，純度較好。因此，對于那些需要高純度DNA樣品的分子生物學(xué)試驗(yàn)而言，是一種簡單經(jīng)濟(jì)，能夠被廣大的實(shí)驗(yàn)室所采納接受的方法。

［1］ Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning：A laboratory manual. 3rd ed ［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001：636-648.

［2］ 趙培, 王振英, 彭永康.瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測小麥基因組DNA RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的方法學(xué)比較［J］.中國生物工程雜志, 2003, 23（8）：96-100.

［3］ 王霞, 王燁, 李琳琳, 等.瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測腸道菌群基因擴(kuò)增產(chǎn)物的方法學(xué)比較研究［J］.新疆醫(yī)學(xué), 2008, 38：136-138.

［4］ 翟紅, 劉慶昌.甘薯胚性懸浮細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 36：487-491.

［5］ Hideaki T, Hiroji A. A common role of CRP in transcription activation：CRP acts transiently to stimulate events leading to open complex formation at a diverse set of promoters ［J］. The EMBO Journal, 1998, 17：1759-1767.

［6］ 黎朋.熒光標(biāo)記DNA片段高效液相色譜質(zhì)譜分析及熒光特性研究［D］.北京：生物能源與環(huán)境計(jì)量科學(xué)和測量技術(shù)研究所, 2010.

［7］ Xu M, Busby SJW. Activation and repression at the Escherichia coli ynfEFGHI operon promoter ［J］. Journal of Bacteriology, 2009, 191（9）：3172-3176.

［8］ Seoh HK, Tai PC. Catabolic repression of secB expression is positively controlledby cyclic AMP （cAMP） receptor protein-cAMP complexes at the transcriptional level ［J］. Journal of Bacteriology, 1999, 181（6）：1892-1899.

［9］ 薛仁鎬, 金圣愛, 孫世孟, 等.瓊脂糖凝膠中DNA片段的擠壓回收法.生物技術(shù), 2006, 16（3）：50-51.

［10］ 王春, 陳琳玲, 許燦新, 等.簡便快速的PCR產(chǎn)物回收方法［J］.南華大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 33（1）：109-111.

［11］ 楊百全, 王利君, 遇長春, 等.磁珠法回收純化DNA樣本［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志（增刊）, 2006（1）：10-11.

［12］ 蔣志飛.活性自由基聚合法制備聚丙烯酰胺及其水凝膠的研究［D］. 重慶：重慶大學(xué), 2007

［13］ 高傳軍.一種從聚丙烯酰胺凝膠上回收D N A片段的簡易方法［J］.科技信息, 2009, 19：6

［14］ 朱玉君, 樊葉楊, 莊杰云.從非變性聚丙烯酰胺凝膠回收純化DNA樣本［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2010（1）：193-195.

［15］ 章蕾, 袁玲, 劉仲華, 等.從非變性聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA小片段的兩種方法比較［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27：227-230.

［16］ 朱曉峰, 安小平, 陳錦輝, 等.一種簡便、高效、經(jīng)濟(jì)的從凝膠中回收DNA的方法［J］.生物技術(shù)通訊, 2006, 17：603 -604.

［17］ 莊飛云, 茅淑敏, 婁群峰, 等.簡便實(shí)用的瓊脂糖凝膠回收DNA片段方法［J］.生物技術(shù)通訊, 2003, 14（3）：202-203.

［18］ 蔣安, 梁慧, 陳旭, 等.回收瓊脂糖凝膠中DNA的簡便方法［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2006（2）：102-103.