大腸桿菌nmpC基因的快速敲除

張丹鳳 陳國平 華秀庭 陳陽

（1.漳州師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，漳州 363000；2.漳州市農(nóng)業(yè)局種植業(yè)管理站，漳州 363000）

革蘭氏陰性細菌的細胞壁有兩層膜——外膜和內(nèi)膜，外膜上有許多的外膜蛋白，其中包括外膜A蛋白、孔蛋白和脂蛋白等［1］。外膜蛋白處于最外層外膜上，它參與了多項生理功能，包括具有讓外界物質(zhì)進入的通道功能、幫助細菌攝取鐵離子、參與革蘭氏陰性細菌感染的粘附和炎癥、激發(fā)宿主產(chǎn)生免疫保護性等生理功能，對于細菌適應(yīng)外界環(huán)境和形成致病能力至關(guān)重要［2］。

NmpC蛋白質(zhì)是一種外膜孔蛋白，組成磷脂雙分子層中的微孔通道，可選擇性地促進親水分子通過革蘭氏陰性細菌的外膜［3］。大腸桿菌 K-12△ompF和△ompC突變株中NmpC的表達量增加［4］；進一步研究表明，大腸桿菌中NmpC蛋白質(zhì)可以取代OmpF或者OmpC的功能，NmpC的表達會降低OmpF和OmpC孔蛋白的表達量［5］。同時大腸桿菌NmpC和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）中NmpC類似蛋白OmpD與OmpN蛋白功能極其相似［6］。NmpC還是一種新發(fā)現(xiàn)的與大腸桿菌耐藥、耐熱相關(guān)的外膜蛋白質(zhì)［7，8］。除此之外，NmpC蛋白的表達受到TolC蛋白表達和nmpC啟動子DNA成環(huán)的調(diào)控［9，10］。從蛋白質(zhì)水平可以更充分地研究蛋白質(zhì)的功能，但是目前還未見從基因刪除的角度來進一步探討NmpC蛋白質(zhì)的功能。因此，基于Red重組系統(tǒng)和Xer重組系統(tǒng)構(gòu)建了無標(biāo)記的ΔnmpC基因刪除菌株，旨在為深入探討NmpC的功能及其分子機制奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌 K-12 BW25113為本實室保存菌種；質(zhì)粒pKD46（溫度敏感型，含有阿拉伯糖啟動子調(diào)控的gam、bet和exo基因，Ampr）和pSK-difGm（含有兩邊帶有dif 位點［11］的慶大霉素抗性基因、Ampr和Gmr）均購于江蘇銳陽生物科技有限公司。質(zhì)粒pMD18-T simple vector 購于TaKaRa寶生物（大連）公司。

1.1.2 試劑和引物 Taq和Pfu DNA聚合酶、連接酶solution I、EcoR I和Hind III限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取、純化試劑盒和膠回收試劑盒為均為 TaKaRa寶生物（大連）公司產(chǎn)品?？股貞c大霉素和氨芐青霉素購于上海生工生物工程股份有限公司。大腸桿菌基因刪除試劑盒購于江蘇銳陽生物科技有限公司。本研究所用引物序列如表1所示。

表1 PCR擴增所用引物

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增nmpC片段 提取大腸桿菌 K-12 BW25113基因組，利用引物nmpC1和nmpC2進行PCR擴 增，PCR體 系 為：基 因 組DNA 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、2.5 mmol/L Mg2+2 μL、25 mmol/L nmpC1和nmpC2各0.3 μL、Taq DNA聚合酶0.4 μL、10×緩沖液 5 μL和ddH2O 36 μL；擴增程序為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 75 s，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物進行電泳和膠回收。

1.2.2 nmpC基因刪除用線性化DNA片段的制備 將膠回收的nmpC片段，通過連接酶solution I與pMD18-T simple vector進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)Hind III單酶切驗證，獲得重組質(zhì)粒pMD-nmpC。該重組質(zhì)粒用EcoR I酶切，切除nmpC片段中150 bp片段，經(jīng)電泳膠回收目的片段pMD-nmpC1。進一步通過Pfu DNA聚合酶補平pMD-nmpC1酶切切口，乙醇沉淀回收目的片段。補平后的目的片段用堿性磷酸酶CIAP進行去磷酸化得到pMD-nmpC2，防止平末端發(fā)生自身連接。Sma I酶切pSK-difGm，獲得difGm片段。difGm片段與pMD-nmpC2連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒T-nmpC∷difGm。經(jīng)Hind III單酶切驗證，獲得含有突變盒的重組質(zhì)粒T-nmpC∷difGm。

1.2.3 突變盒片段的PCR 擴增 將含有突變盒片段的重組質(zhì)粒T-nmpC∷difGm用Hind III酶切線性化，電泳回收線性的重組質(zhì)粒片段，去除環(huán)形質(zhì)粒。以該片段為模板，利用引物nmpC1和nmpC2 PCR擴增獲得突變盒nmpC∷difGm，膠回收PCR 產(chǎn)物獲得高濃度突變盒片段。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化突變盒片段入大腸桿菌細胞 通過CaCl2轉(zhuǎn)化法將pKD46轉(zhuǎn)化大腸桿菌 K-12 BW25113。將含有pKD46的大腸桿菌 K-12 BW25113接種于LB平板，30℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基，30℃條件下200 r/min過夜培養(yǎng)。取0.5 mL 培養(yǎng)液接種于50 mL含有氨芐青霉素（100 μg/mL）和2 mmol/L L-阿拉伯糖的新鮮LB 液體培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)至A600值約為0.7。將培養(yǎng)液迅速置于冰上冷卻20 min，4℃、4 000 r/min離心10 min 收集菌體。傾倒培養(yǎng)基，并輕柔地將菌體重新懸浮于20 mL預(yù)冷的10%（V/V）甘油溶液中，離心收集菌體，并將菌體重懸于20 mL預(yù)冷的10%（V/V）甘油溶液中，并重復(fù)該步驟2次，將上清液傾倒，并將菌體用殘留的約100 μL 10%（V/V）甘油溶液重懸。輕柔地將50 μL菌體溶液與35 μL純化后的突變盒PCR 產(chǎn)物混合，置于0.1 cm預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)儀1.8 kV進行電擊，電擊時間為4-5 ms。迅速加入1 mL 含有1 mmol/L L-阿拉伯糖的LB 液體培養(yǎng)基，將菌液在37℃培養(yǎng)1 h后，涂布于含有慶大霉素（30 g/mL）的LB 固體培養(yǎng)基上篩選重組菌株。

1.2.5 陽性轉(zhuǎn)化子的驗證 挑取慶大霉素抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)化子，利用引物Gm1和nmpC3進行菌落PCR驗證大腸桿菌 K-12 BW25113和重組菌株，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.6 Xer重組酶系介導(dǎo)的慶大霉素抗性基因的去除 將陽性轉(zhuǎn)化子接種于LB 液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，然后轉(zhuǎn)接于新鮮LB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h。稀釋培養(yǎng)液至適當(dāng)濃度，涂布LB平板，37℃培養(yǎng)。挑取單菌落同時點種于含慶大霉素的固體LB平板和不含慶大霉素的普通固體LB平板，挑選慶大霉素抗性丟失的轉(zhuǎn)化子（在dif 位點進行了Xer 重組的細胞失去了慶大霉素抗性），并用nmpC1和nmpC2引物進行進一步的菌落 PCR 擴增驗證，最終獲得沒有抗生素標(biāo)記的基因刪除菌株。

2 結(jié)果

2.1 試驗方案設(shè)計

經(jīng)Vector NTI軟件分析nmpC基因內(nèi)部有2個EcoR I位點，2個位點中間有150 bp的堿基序列，通過酶切去除這150 bp堿基，并經(jīng)Pfu補平后與經(jīng)Sma I酶切獲得的difGm片段進行連接。在2個EcoR I位點外圍各擴增500 bp堿基作為同源臂用于整合，在Red 重組酶的作用下進行雙交換，將目的基因替換，進一步在自身Xer重組酶的介導(dǎo)下，進行2個dif位點的重組將抗生素標(biāo)記基因去除。

2.2 重組質(zhì)粒pMD-nmpC的構(gòu)建

利用引物nmpC1和nmpC2對nmpC進行PCR擴增，獲得與預(yù)期1 016 bp的片段大小相當(dāng)?shù)哪康钠?，結(jié)果如圖1-A所示。將該目的片段與pMD18-T simple vector進行連接，獲得pMD-nmpC重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒圖譜如圖2-A所示。提取pMDnmpC重組質(zhì)粒，經(jīng)Hind III酶切，圖1-B第2泳道顯示酶切片段大小約為3 703 bp，成功獲得了含有nmpC基因片段的重組質(zhì)粒。

2.3 重組質(zhì)粒T-nmpC∷difGm的構(gòu)建

大量提取pMD-nmpC，利用EcoR I酶切去除nmpC基因中150 bp的片段，得到約3.6 kb的pMD18-nmpC1片段（圖1-B第3泳道）。Sma I酶切pSK-difGm，獲得difGm片段，difGm片段與去磷酸化的、補平酶切切口的pMD18-nmpC2連接，獲得重組質(zhì)粒T-nmpC∷difGm，其物理圖譜如圖2-C所示。用Hind III對T-nmpC∷difGm進行單酶切，如圖3-A所示獲得大小為4 585 bp的目的條帶，與預(yù)期大小一致。

圖1 nmpC基因PCR擴增片段（A）及pMD-nmpC重組質(zhì)粒（B）

2.4 nmpC∷difGm的PCR 擴增

用Hind III對T-nmpC∷difGm重組質(zhì)粒進行酶切，進行膠回收，獲得線性化的T-nmpC∷difGm。以此目的片段為模板，通過引物nmpC1和nmpC2進行PCR擴增獲得突變盒nmpC∷difGm，獲得大小約1 900 bp的目的條帶，與預(yù)計的片段大小相當(dāng)（圖3-B）。

2.5 ΔnmpC基因刪除菌株的鑒定

膠回收突變盒nmpC∷difGm，獲得高濃度的純化的突變盒，將其電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 K-12 BW25113細胞中。慶大霉素抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)化子，通過引物Gm1和nmpC3經(jīng)菌落PCR驗證確認(rèn)，獲得片段大小約1.2 kb的目的片段（圖4第1泳道）。依次傳代去除慶大霉素抗性和pKD46，獲得不具有慶大霉素抗性的目標(biāo)菌株。經(jīng)菌落PCR驗證（引物nmpC1和nmpC2）只獲得大小約850 bp的片段（圖4第5泳道）。結(jié)果顯示，成功獲得了ΔnmpC基因突變無標(biāo)記菌株。

3 討論

圖2 重組質(zhì)粒物理圖譜

圖3 T-nmpC∷difGm酶切（A）及nmpC∷difGm PCR擴增（B）產(chǎn)物

圖4 nmpC基因刪除轉(zhuǎn)化子PCR鑒定電泳圖譜

基因刪除技術(shù)是一種從分子水平上定向改變生物活體遺傳信息的試驗手段，對于研究基因和蛋白功能等生命科學(xué)的重大問題十分重要?；讦耸删wRed重組酶作用的同源重組技術(shù)逐漸成為基因工程研究的熱點之一，BaBa等［12］利用這種方法，已經(jīng)對大腸桿菌 K-12中3 985個目的基因進行刪除，并由此建立起新的大腸桿菌基因庫（http：//ecoli.aist-nara.ac.jp/）。但是該方法在去除抗生素標(biāo)志時，需要進行帶有相應(yīng)重組酶基因的外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，使試驗周期延長。Bloor 等［11］采用Red重組系統(tǒng)-Xer重組系統(tǒng)，實現(xiàn)靶基因重組后抗生素標(biāo)記高效刪除，方法簡便。目前該技術(shù)已經(jīng)在多種微生物細胞成功獲得無抗生素標(biāo)記的基因刪除菌株，包括大腸桿菌、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）、分枝桿菌（Mycobacteria）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等［13，14］。本研究運用該技術(shù)利用大腸桿菌細胞中自身Red重組系統(tǒng)-Xer重組系統(tǒng)，通過PCR驗證獲得無抗生素標(biāo)記的基因刪除菌株ΔnmpC。NmpC的表達量與OmpF和OmpC的表達呈負相關(guān)［4，5］，期望利用該基因刪除菌株來深入探討NmpC的缺失表達對OmpF和OmpC表達的影響，甚至與調(diào)控OmpF和OmpC表達的EnvZ/OmpR雙調(diào)節(jié)系統(tǒng)之間的關(guān)系。NmpC是新發(fā)現(xiàn)的與大腸桿菌適應(yīng)逆境的外膜蛋白［7，8］，通過ΔnmpC可以進一步驗證它在大腸桿菌耐受不利環(huán)境過程中的作用，及與其它相關(guān)功能蛋白間錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，均將促進NmpC外膜蛋白功能的闡明。

4 結(jié)論

首次成功地在大腸桿菌Red 重組系統(tǒng)和Xer重組系統(tǒng)的介導(dǎo)下，獲得大腸桿菌ΔnmpC無抗生素標(biāo)記基因刪除菌株，該基因刪除菌株將有利于進一步探討NmpC在大腸桿菌不同生理過程的作用及其它功能。

［1］ Solov’eva TF, Novikova OD, Portnyagina OY. Biogenesis of β-Barrel integral proteins of bacterial outer membrane ［J］. Biochemistry （Mosc）, 2012, 77（11）：1221-1236.

［2］ Gimeno C, Navarro D, Savall F, et al. Relationship between outer membrane protein profiles and resistance to ceftazidime, imipenem, and ciprofloxacin in Pseudomonas aeruginosa isolates from bacteremic patients ［J］. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 1996, 15（1）：82-85.

［3］ Hindahl MS, Crockford GW, Hancock RE. Outer membrane protein NmpC of Escherichia coli：pore-forming properties in black lipid bilayers ［J］. Journal of Bacteriology, 1984, 159（3）：1053-1055.

［4］ Lee DR, Schnaitman CA, Pugsley AP. Chemical heterogeneity of major outer membrane pore proteins of Escherichia coli ［J］. Journal of Bacteriology, 1979, 138（3）：861-870.

［5］ Prilipov A, Phale PS, Koebnik R, et al. Identification and characterization of two quiescent porin genes, nmpC and ompN, in Escherichia coli BE ［J］. Journal of Bacteriology, 1998, 180（13）：3388-3392.

［6］ Singh SP, Miller S, Williams YU, et al. Immunochemical structure of the OmpD porin from Salmonella typhimurium ［J］. Microbiology, 1996, 142（11）：3201-3210.

［7］ Gautam A, Vinson HM, Gibbs PS, et al. Proteomic analysis of multidrug resistant Escherichia coli strains from scouring calves ［J］. Veterinary Microbiology, 2011, 151（3-4）：363-371.

［8］ Ruan L, Pleitner A, G?nzle MG, et al. Solute transport proteins and the outer membrane protein NmpC contribute to heat resistance of Escherichia coli AW1.7 ［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77（9）：2961-2967.

［9］ Morona R, Reeves P. The tolC locus of Escherichia coli affects the expression of three major outer membrane proteins ［J］. Journal of Bacteriology, 1982, 150（3）：1016-1023.

［10］ Coll JL, Heyde M, Portalier R. Expression of the nmpC gene of Escherichia coli K-12 is modulated by external pH. Identification of cis-acting regulatory sequences involved in this regulation ［J］. Molecular Microbiology, 1994, 12（1）：83-93.

［11］ Bloor AE, Cranenburgh RM. An efficient method of selectable marker gene excision by Xer recombination for gene replacement in bacterial chromosomes ［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72（4）：2520-2525.

［12］ Baba T, Ara T, Hasegawa M, et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants：the Keio collection ［J］. Molecular Systems Biology, 2006, 2：2006.0008.

［13］ Debowski AW, Gauntlett JC, Li H, et al. Xer-cise in Helicobacter pylori：one-step transformation for the construction of markerless gene deletions ［J］. Helicobacteria, 2012, 17（6）：435-443.

［14］ Cascioferro A, Boldrin F, Serafini A, et al. Xer site-specific recombination, an efficient tool to introduce unmarked deletions into mycobacteria ［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76（15）：5312-5316.