TRAIL聯(lián)合放射線對肺癌細(xì)胞增殖及凋亡影響

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 腫瘤科； 2 腫瘤放療中心； 3 中心實(shí)驗(yàn)室)

肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，是目前世界上發(fā)病率及病死率均居首位的腫瘤，并且呈逐年上升的趨勢。肺癌分為小細(xì)胞肺癌及非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占75%左右。非小細(xì)胞肺癌的主要治療方式包括手術(shù)切除、放療、化療、分子靶向治療和生物免疫療法。在我國，非小細(xì)胞肺癌病人診斷時(shí)大多數(shù)已處于中晚期，喪失了手術(shù)治療的時(shí)機(jī)，而放療、化療雖能提高局部控制率，但同時(shí)正常細(xì)胞和組織也受到損傷，有時(shí)甚至抵消了局部控制率提高帶來的益處。因此，目前亟需能夠改善局部及遠(yuǎn)期控制率的腫瘤特異性治療方法。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子超家族新成員[1-2]。TRAIL通過與死亡受體DR4、DR5結(jié)合，啟動(dòng)一系列凋亡信號傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明，TRAIL能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞沒有損傷，成為目前腫瘤生物治療研究的新熱點(diǎn)[1]。但有資料顯示，部分腫瘤細(xì)胞對TRAIL表現(xiàn)出抵抗性或耐受性，且反復(fù)使用TRAIL也可產(chǎn)生獲得性耐藥，而與放療、化療、免疫治療結(jié)合的聯(lián)合治療方法，能夠發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用[3-12]。本研究通過Lewis 肺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)，觀察TRAIL單獨(dú)應(yīng)用及聯(lián)合X射線照射對體外腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Lewis肺癌細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，TRAIL蛋白由上海恰爾生物技術(shù)有限公司惠贈，MTT購于美國Sigma公司，AnnexinV-Alexa Fluor 488/PI試劑盒購于Invitrogen公司，流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Lewis肺癌來源于C57BL小鼠，其細(xì)胞株為半貼壁生長的細(xì)胞，采用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、青鏈霉素各100 mg/g的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為5×107/L，每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，分別加入濃度為0、10、50、100、200、400、800 μg/L的TRAIL(為培養(yǎng)孔中的終濃度)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔(加同體積的培養(yǎng)液)，分別作用12、24、48 h后加入MTT溶液(終濃度為5 kg/L)，震蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫分析儀于490 nm處測量吸光度(A)值。按如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR)：IR=((對照組平均A值-空白組平均A值)-(實(shí)驗(yàn)組平均A值-空白組平均A值))/(對照組平均A值-空白組平均A值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，以5×108/L的密度接種于12.5 mm2培養(yǎng)瓶中，并隨機(jī)分為空白組(A組)、TRAIL組(B組)、單純照射組(C組)和照射+TRAIL組(D組)。培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，B組及D組加入濃度為100 μg/L的TRAIL[13]，A組及C組加入等量培養(yǎng)液，作用12 h后，C組及D組給予2 Gy的6 MV的X線照射[7]，A組及B組只擺位未照射。按照凋亡試劑盒的步驟收集作用24 h后Lewis細(xì)胞，用Annexin V-FITC和PI染色，常溫避光孵育15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測凋亡率；按照細(xì)胞周期試劑盒步驟檢測細(xì)胞周期。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度TRAIL對Lewis細(xì)胞增殖作用的影響

不同濃度TRAIL作用于Lewis肺癌細(xì)胞，其抑制率比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.017～12.465，P<0.05)。見表1。

2.2 各組細(xì)胞凋亡比較

D組的凋亡率與A、B、C組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=203.175，P<0.05)。見圖1、表2。

2.3 各組細(xì)胞周期比較

D組G2/M期所占比例與A、B、C組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=149.276，P<0.05)。見圖2、表2。

表1 不同濃度TRAIL對Lewis細(xì)胞抑制率的影響

表2 各組凋亡率及G2/M期所占比例

3 討 論

TRAIL即凋亡素2配體(Apo2L)，于1995年由WILEY首先報(bào)道，是腫瘤壞死因子超家族成員之一，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，其mRNA廣泛表達(dá)于正常人的脾、肺、腎、胸腺、前列腺、心臟、胎盤等多種組織中，而在腦、肝和睪丸中無表達(dá)[1-2]。TRAIL的受體有DR4、DR5、DcR1、DcR2及OPG，其中死亡受體DR4、DR5是介導(dǎo)Apo2L/TRAIL誘導(dǎo)凋亡的受體。TRAIL通過兩條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：線粒體依賴途徑(外源性通路)和非線粒體依賴途徑(內(nèi)源性通路)，其中非線粒體依賴途徑是TRAIL誘導(dǎo)凋亡的主要方式。兩條凋亡途徑都是通過激活一系列半胱-天冬氨酸蛋白酶(caspase)從而引發(fā)細(xì)胞最終凋亡。但是由于腫瘤細(xì)胞的個(gè)體差異性，不同腫瘤對TRAIL的敏感性不同，許多腫瘤細(xì)胞對其表現(xiàn)出抵抗性或經(jīng)過長期治療后出現(xiàn)耐藥。因此，通過其他治療方式增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對TRAIL的敏感性成為Apo2L /TRAIL治療腫瘤的關(guān)鍵所在。

放射線直接或間接引起DNA損傷，通過DNA損傷介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及MAPK、AKt/PKB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以激活一系列基因、因子或蛋白[14]，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而TRAIL作用于腫瘤細(xì)胞后能夠引起DR4、DR5的高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。國外有文獻(xiàn)報(bào)道，TRAIL與放射線聯(lián)合在體外能夠引起多種腫瘤細(xì)胞凋亡率增加，DR4或DR5表達(dá)增加；而在體內(nèi)則能夠減緩或抑制腫瘤生長[15-18]。

A～D分別為A、B、C、D組流式細(xì)胞儀檢測所得出的散點(diǎn)圖，橫軸為Annexin V染色，縱軸為PI染色。

A～D分別為A、B、C、D組流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TRAIL對Lewis肺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，且呈劑量限制性，其抑制作用的實(shí)質(zhì)是促凋亡作用。X射線也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。X射線與TRAIL聯(lián)合作用于Lewis肺癌細(xì)胞，可使其凋亡率明顯升高，G2/M期比例顯著升高，與對照組、單用TRAIL組及單用X射線照射組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本文在細(xì)胞水平驗(yàn)證了TRAIL可對肺癌細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡作用，而與高能X射線聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)TRAIL凋亡誘導(dǎo)作用。TRAIL作用于Lewis細(xì)胞24 h的半數(shù)抑制劑量IC50達(dá)到19 mg/L，與對TRAIL敏感腫瘤細(xì)胞(24 h IC50≤100 μg/L)相比，Lewis細(xì)胞對此藥的敏感性較低。其原因可能由于Lewis細(xì)胞為鼠源性的肺癌細(xì)胞，因種屬的差異，細(xì)胞表面TRAIL受體的表達(dá)存在差異，誘導(dǎo)凋亡的作用不如對人源性腫瘤細(xì)胞敏感性高[19]，具體原因尚需要進(jìn)一步研究。

既往資料顯示，放射線可克服TRAIL非敏感的腫瘤細(xì)胞對TRAIL的抵抗性[20]。其可能的機(jī)制包括：死亡受體DR4、DR5表達(dá)增加；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成員caspase8、caspase9、caspase3等的表達(dá)[16-21]。除此之外，兩者的聯(lián)合治療還涉及細(xì)胞因子及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因。有研究結(jié)果表明，死亡受體的上調(diào)與細(xì)胞核因子NF-κB的激活、cFLIP及IAPs的過度表達(dá)、Bax和Bak基因突變等有關(guān)[22]。有文獻(xiàn)報(bào)道，TRAIL引起的凋亡不依賴于p53的表達(dá)，且與Bcl-2的水平呈負(fù)相關(guān)[23]。但也有資料證明，死亡受體DR5 mRNA的上調(diào)與p53有關(guān)[24]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，TRAIL聯(lián)合放射線可以提高腫瘤對TRAIL的敏感性并增強(qiáng)其促凋亡作用，具體機(jī)制尚在研究中。TRAIL與放射線的聯(lián)合治療增加了對腫瘤的殺傷作用，有望成為腫瘤治療史上令人期待的新方案。

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