非小細(xì)胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與化療耐藥性的相關(guān)性

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266003)

肺癌是當(dāng)今世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的75%～80%，5 年生存率平均不到50%[1]。目前臨床多采用手術(shù)與放、化療結(jié)合的綜合治療方案，其中順鉑是臨床上NSCLC化療方案中必不可少的一線藥物。但是治療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥性是影響療效的重要因素，現(xiàn)在臨床多通過(guò)檢測(cè)DNA修復(fù)家族成員核苷酸切除修復(fù)基因1(ERCC1)來(lái)評(píng)估腫瘤組織的順鉑耐藥性。已有研究顯示，高表達(dá)耐藥蛋白的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出與親本細(xì)胞不同的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，耐藥癌細(xì)胞系的侵襲轉(zhuǎn)移力顯著提高，腫瘤多藥耐藥與侵襲轉(zhuǎn)移存在一定的內(nèi)在聯(lián)系[2]；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3-5]，提示在腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中，EMT的發(fā)生和腫瘤耐藥性之間可能存在著一定的相關(guān)性。本研究從組織學(xué)角度證實(shí)化療耐藥性的發(fā)生與EMT有關(guān)，為化療耐藥性的研究拓展新的思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及其來(lái)源

收集青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及青島市市立醫(yī)院病理科近5年NSCLC新輔助化療后手術(shù)切除標(biāo)本40例(新輔助化療組，其中12例有術(shù)前未作化療時(shí)的活檢標(biāo)本)，同時(shí)收集2011年7月—2012年6月手術(shù)切除的NSCLC組織標(biāo)本40例(單純手術(shù)組，術(shù)前未經(jīng)化療)。新輔助化療組均給予以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療(其中28例為NP方案：重酒石酸長(zhǎng)春瑞濱+順鉑，12例為GP方案：鹽酸吉西他濱+順鉑)，術(shù)前行2周期化療，化療后3周左右手術(shù)。

1.2 主要試劑

鼠抗人E-鈣黏素(E-cadherin)單克隆抗體、鼠抗人波形蛋白(vimentin)單克隆抗體、鼠抗人CK單克隆抗體、鼠抗人ERCC1單克隆抗體、PV-6000檢測(cè)試劑盒及DAB顯色劑，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

所有組織標(biāo)本均制成4 μm厚度的連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，系列乙醇水化至蒸餾水，含體積分?jǐn)?shù)0.03的過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高壓修復(fù)；采用免疫組織化學(xué)PV-6000二步法染色；其中一抗ERCC1濃度為1∶100，E-cadherin為1∶200，vimentin為1∶100；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

ERCC1以腫瘤細(xì)胞核和(或)細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色為陽(yáng)性，E-cadherin以腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色為陽(yáng)性，vimentin以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色為陽(yáng)性。免疫組化結(jié)果根據(jù)染色深淺和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩項(xiàng)綜合分析：每例標(biāo)本在400倍視野下隨機(jī)選取500個(gè)腫瘤細(xì)胞，觀察陽(yáng)性細(xì)染色強(qiáng)度，并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色或棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分：50%為3分。以染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分相加所得總分判定結(jié)果：0～1分為陰性(-)，2～6分為陽(yáng)性(+)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)間比較采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney Test)，兩變量間相關(guān)性分析采用Spearman分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組ERCC1與EMT表型蛋白之間的相關(guān)性

新輔助化療組ERCC1陰性表達(dá)11例，陽(yáng)性表達(dá)29例(72.5%)；vimentin陰性者13例，陽(yáng)性27例(57.5%)；E-cadherin陰性者31例，陽(yáng)性9例(29.0%)。vimentin和ERCC1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.482，P<0.05)；E-cadherin和ERCC1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.519，P<0.05)。見表1。

單純手術(shù)組ERCC1陰性表達(dá)19例，陽(yáng)性表達(dá)21例(52.5%)；vimentin陰性表達(dá)21例，陽(yáng)性表達(dá)19例(47.5%)；E-cadherin陰性表達(dá)27例，陽(yáng)性表達(dá)13例(32.5%)。vimentin和ERCC1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.405，P<0.05)；E-cadherin和ERCC1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.346，P<0.05)。見表1。

2.2 兩組E-cadherin、vimentin和ERCC1的表達(dá)情況比較

新輔助化療組與單純手術(shù)組的E-cadherin、vi-mentin和ERCC1表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見表2。

2.3 E-cadherin、vimentin和ERCC1表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

新輔助化療組和單純手術(shù)組低分化癌病人的ERCC1、E-cadherin和vimentin表達(dá)強(qiáng)度與分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(Z=-2.031～-1.976，P<0.05)，而與病理類型、性別及年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)。新輔助化療組EMT現(xiàn)象以及腫瘤耐藥性均比單純手術(shù)組明顯，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、4。

3 討 論

近年來(lái),NSCLC治療領(lǐng)域取得了較大的進(jìn)展，引進(jìn)多學(xué)科綜合治療和靶向治療為代表的新治療方法的同時(shí)，傳統(tǒng)化療依然是肺癌主要的治療手段之一。但是腫瘤細(xì)胞普遍存在多藥耐藥現(xiàn)象，是影響療效的重要因素。肺癌化療過(guò)程中常用的順鉑抗癌作用的主要靶點(diǎn)為DNA，兩者可以共價(jià)結(jié)合形成順鉑-DNA復(fù)合物，引起DNA損傷，從而造成細(xì)胞死亡[6]。DNA損傷修復(fù)基因ERCC1主要參與DNA損傷的核苷酸切除修復(fù)，可以修復(fù)順鉑等多種原因所引起的DNA損傷，因此ERCC1過(guò)表達(dá)提示腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性增強(qiáng)[7]。目前，國(guó)際上公認(rèn)檢測(cè)ERCC1是評(píng)估NSCLC順鉑耐藥性的重要指標(biāo)之一，但是關(guān)于化療耐藥的機(jī)制不完全清楚。

越來(lái)越多的研究顯示，腫瘤細(xì)胞的EMT與化療耐藥性之間有著密切的聯(lián)系[8]，因此對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT機(jī)制的研究有可能成為了解化療耐藥性關(guān)鍵所在。EMT指上皮細(xì)胞暫時(shí)喪失原有的細(xì)胞極性，細(xì)胞間黏附減少，表現(xiàn)出具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞特征; 同時(shí)細(xì)胞表型發(fā)生改變，即上皮表型標(biāo)志物E-cadherin 等表達(dá)下調(diào)、vimentin等間充質(zhì)表型標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，其中最具特征性的是E-cadherin表達(dá)下調(diào)。現(xiàn)已證實(shí)，EMT存在于多種病理過(guò)程中，如傷口愈合、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移，是目前腫瘤轉(zhuǎn)移研究的熱點(diǎn)之一[8]，其最有力的證據(jù)是EMT的調(diào)控基因或信號(hào)通路廣泛地參與腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移的過(guò)程[9]。隨著腫瘤浸潤(rùn)性與EMT的相關(guān)性研究的深入，EMT與腫瘤耐藥性相關(guān)性研究也逐漸受到重視。目前，對(duì)EMT與化療耐藥性相關(guān)性的研究主要采用體外培養(yǎng)細(xì)胞系。YANG等[10]研究結(jié)果表明，耐奧沙利鉑的結(jié)直腸癌細(xì)胞出現(xiàn)EMT現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、極性喪失，黏附性降低、偽足形成等；免疫熒光示細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E-cadherin和橋粒斑蛋白表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin 表達(dá)上調(diào)。RHO等[11]成功建立了NSCLC耐吉非替尼細(xì)胞系A(chǔ)549/GR，并且也觀察到上述的EMT 現(xiàn)象，細(xì)胞在Transwell小室中侵襲性及運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。THOMSON等[12]將能夠耐受埃羅替尼的NSCLC細(xì)胞(H460和Calu6)接種至小鼠體內(nèi)，其腫瘤組織檢測(cè)不到E-cadherin表達(dá)或表達(dá)少量E-cadherin，而埃羅替尼敏感的NSCLC細(xì)胞(H292)接種瘤體則高表表達(dá)E-cadherin；相反，纖連蛋白(fibronectin)和vimentin只在耐藥組中高表達(dá)。

表1 新輔助化療組與單純手術(shù)組ERCC1和vimentin、E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性(例)

表2 新輔助化療組與單純手術(shù)組ERCC1、E-cadherin和vimentin表達(dá)陽(yáng)性率比較(例)

表3 兩組ERCC1表達(dá)與臨床病理的關(guān)系(例)

表4 新輔助化療組和單純手術(shù)組vimentin和E-cadherin表達(dá)與臨床病理的關(guān)系(例)

鑒于上述研究均建立在細(xì)胞系研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選用NSCLC單純手術(shù)組及新輔助化療組手術(shù)標(biāo)本，在前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇分化程度構(gòu)成比相近的病例，對(duì)比分析E-cadherin、vimentin和ERCC1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示兩組腫瘤組織中vimentin和ERCC1表達(dá)呈正相關(guān)，E-cadherin和ERCC1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞化療耐藥性增強(qiáng)，也就是說(shuō)EMT和腫瘤化療耐藥性之間聯(lián)系緊密。另外，兩組之間各種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)比較結(jié)果顯示，新輔助化療組EMT現(xiàn)象以及腫瘤耐藥性均比單純手術(shù)組明顯，雖然其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因一方面可能與所選病例數(shù)量相對(duì)有限有關(guān)，另一方面提示腫瘤耐藥性的產(chǎn)生以及EMT表型的獲得可能與處理方式聯(lián)系不緊密，而與腫瘤的異質(zhì)性有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述, NSCLC化療耐藥性與EMT現(xiàn)象呈正相關(guān)。深入研究NSCLC化療抵抗與EMT產(chǎn)生的機(jī)制，對(duì)于預(yù)測(cè)腫瘤化療的敏感性，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤病人的個(gè)體化治療，具有重要的臨床意義。

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