SKF 38393 對(duì)伏隔核神經(jīng)元興奮性突觸后電流的作用研究

劉宇煒，黃 丹，陳曉青，許曉利，艾永循

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

伏隔核位于前腦基底，屬邊緣系統(tǒng)，主要接受來自中腦腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺能及內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)的谷氨酸能神經(jīng)支配［1－2］，傳出纖維主要投射至腹側(cè)蒼白球，是邊緣系統(tǒng)和錐體外運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的整合中樞，在行為、動(dòng)機(jī)、獎(jiǎng)賞和毒品成癮等多種功能活動(dòng)中起重要作用，并與多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)生密切相關(guān)［3］。

在伏隔核，多巴胺作為一種關(guān)鍵性神經(jīng)遞質(zhì)，在控制獎(jiǎng)賞基礎(chǔ)上的認(rèn)知活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用［4］。目前已分離出5 種多巴胺受體，根據(jù)它們的生物化學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，可分為D1 類和D2 類受體。D1 類受體包括D1 和D5 受體，D2 類受體包括D2、D3 和D4 受體。有報(bào)道指出多巴胺可激活突觸前D1 受體而抑制誘發(fā)興奮性突觸后電流［5］。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄D1 受體選擇性激動(dòng)劑SKF 38393 對(duì)大鼠伏隔核棘狀神經(jīng)元自發(fā)興奮性突觸后電流的影響。研究表明其作用隨著藥物濃度的變化而發(fā)生改變，其對(duì)大鼠伏隔核棘狀神經(jīng)元谷氨酸受體介導(dǎo)的突觸傳遞起雙向的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague－Dawley 大鼠，鼠齡17～32 天，雌雄不限，由江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。該中心獲得湖北省科學(xué)技術(shù)廳頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證》（許可證號(hào)：syxk（鄂）2012－0042，有效期為2012. 3. 5－ 2017. 3. 4）。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，盡可能減少動(dòng)物的痛苦及使用數(shù)量。

D1 受體的選擇性激動(dòng)劑（SKF 38393），荷包牡丹堿（bicuculline）和6－氰基－7－硝基喹惡啉土衛(wèi)四（6，7－dinitroquinoxaline－2，3－dione，DNQX）購(gòu)自Sigma 公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

孵育液（mmol/L）：glycerol 250，KCl 1.6，NaH2PO41.2，MgCl21.2，CaCl22.4，NaHCO325，glucose 11，調(diào)pH 值至7.3。

人工腦脊液（ACSF）（mmol/L）：NaCl 125，KCl 1.6，NaH2PO41.2，MgCl21.2，CaCl22.4，NaHCO325，glucose 11，調(diào)pH 值至7.3。

電極內(nèi)液（mmol/L）：CsF 135，KCl 5，MgCl22，Hepes 10，Mg ATP 2，GTP 0.2，調(diào)pH 值至7.2。

1.2 方法

1.2.1 大鼠伏隔核腦片的制備 參照筆者以前的實(shí)驗(yàn)方法［6］，并在此基礎(chǔ)上稍加改進(jìn)：無菌條件下迅速將大鼠斷頭取腦，置于混合氣（95% O2/5% CO2）飽和的冰冷（0～4 ℃）孵育液中約5 min。在0 ℃通混合氣條件下，采用振動(dòng)切片機(jī)（VF－300，美國(guó)Precisionary 公司）將伏隔核腦組織切成250 μm 厚的冠狀切片，置于混合氣飽和的孵育液中，室溫（22～24 ℃）下孵育至少1 h 以上。

1.2.2 電生理記錄 玻璃微電極由P－97 電極拉制儀（美國(guó)Sutter 公司）分兩步拉制，充灌電極內(nèi)液后阻抗為4～6 MΩ。將腦片置于操作臺(tái)正中約0.4 mL 凹槽內(nèi)，用一鉑金環(huán)壓住。BX51 正置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下選大鼠伏隔核神經(jīng)元。全細(xì)胞膜片鉗記錄所用儀器為Axopatch 700B 膜片鉗放大器（美國(guó)Molecular 公司），在電極與細(xì)胞膜之間形成高阻（1 GΩ～5 GΩ）封接后，進(jìn)一步將膜吸穿，調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻補(bǔ)償。數(shù)據(jù)以5 kHz 過濾，使用Axonscope 1.1.1 acquisition 軟件通過Axon DigiData－1440A 記錄于電腦上。整個(gè)記錄過程中采用混合氣飽和的人工腦脊液持續(xù)灌流，灌流速度約2 mL/min。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Sigmaplot 11.0（Jandel Scientific）和SPSS 16.0 進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)分析和制圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean ± Ssem）表示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D1 受體激動(dòng)劑在較低濃度（100 nmol/L）時(shí)，增加sEPSC 頻率，對(duì)幅度沒有影響

伏隔核神經(jīng)元大致分兩種類型：投射神經(jīng)元和中間神經(jīng)元，其中投射神經(jīng)元在數(shù)量上占絕大多數(shù)（約95 %），其特征為具有中等大小的胞體（直徑約15 μm），樹突上分布著大量樹突棘，也被稱為棘狀神經(jīng)元（medium spiny neuron，MSN）。在荷包牡丹堿（10 μmol/L）存在條件下，膜電位（VH）鉗制于－75 mV 時(shí)，在棘狀神經(jīng)元上可記錄到自發(fā)興奮性突觸后電流（sEPSCs），這些電流可被二硝基喹酮（6，7－Dinitro－1，4－dihydro－quinoxaline－2，3－dione，DNQX）（20 μmol/L，未作圖示）所完全阻斷，證明其為α－氨基羥甲基惡唑丙酸（α－amino－3－h(huán)ydroxy－5－methyl－4－isoxazole propionic acid，AMPA）受體所介導(dǎo)。如圖1A所示，在較低濃度SKF 38393（100 nmol/L）作用下，自發(fā)興奮性突觸后電流頻率增加了（15.3 ±1.7）%（n = 7；P ＜0.05，圖1A 和圖1C），幅度未發(fā)生明顯改變（（6.2 ± 1.1）%，n= 7；P ＞0.05，圖1A 和圖1B），10%～90%激活時(shí)間和衰減時(shí)間常數(shù)均未改變（n= 7；P ＞0.05，圖1 B）。以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見表1。

圖1 100 nmol/L SKF 38393 對(duì)伏隔核神經(jīng)元興奮性突觸后電流的作用

2.2 D1 受體激動(dòng)劑在較高濃度時(shí)（10 μmol/L）時(shí)，對(duì)sEPSC 頻率無明顯影響，而顯著升高其幅度

接下來將SKF 38393 濃度增加到10 μmol/L。在濃度條件下，SKF 38393 大幅增加自發(fā)興奮性突觸后電流幅度（（48.5 ± 5.1）%，n = 8；P ＜0.001，圖2A 和圖2B），而不改變其頻率（（5.2 ±1.0）%，n= 8；P ＞0.05，圖2A 和圖2C）。對(duì)電流特性的進(jìn)一步分析表明，其10%～90 %激活時(shí)間未發(fā)生明顯改變，而其衰減時(shí)間常數(shù)增加了（26.0±2.4）%（n=8；P ＜0.01，圖2B 和表1）。

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在著獎(jiǎng)賞系統(tǒng)（rewarding system），該系統(tǒng)主要涉及弓狀核、杏仁核、藍(lán)斑、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）、伏隔核（nucleus accumbens，NAcc）等腦區(qū)。目前認(rèn)為，依賴性藥物及其所有的天然獎(jiǎng)賞性刺激（如美食等）都是通過作用于該系統(tǒng)最終引起伏隔核多巴胺釋放增多，從而產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)；腹側(cè)被蓋區(qū)和伏隔核是依賴性藥物引起獎(jiǎng)賞作用的最后通路［1－3］。

表1 SKF 38393 對(duì)伏隔核神經(jīng)元興奮性突觸后電流的影響

圖2 10 μmol/L SKF 38393 對(duì)伏隔核神經(jīng)元興奮性突觸后電流的作用

動(dòng)物在伏隔核內(nèi)注入多巴胺受體激動(dòng)劑后可表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)增多，這是由于機(jī)體的“易化”作用所引起的。動(dòng)物出現(xiàn)激勵(lì)、準(zhǔn)備反應(yīng)。中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)被認(rèn)為是獎(jiǎng)賞效應(yīng)的神經(jīng)基礎(chǔ)，伏隔核在獎(jiǎng)賞效應(yīng)中的作用很早就被人們所重視，支持伏隔核在獎(jiǎng)賞效應(yīng)中作用的最直接證據(jù)是動(dòng)物自我給予多巴胺類似物（即直接用多巴胺受體激動(dòng)劑）或增加細(xì)胞外多巴胺的藥物。這些獎(jiǎng)賞物質(zhì)可作為強(qiáng)化劑使動(dòng)物不斷地重復(fù)某種行為以獲得獎(jiǎng)賞或欣快的感覺。作為獎(jiǎng)賞通路的中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)也是成癮藥物產(chǎn)生依賴的神經(jīng)基礎(chǔ)，許多促進(jìn)多巴胺釋放的藥物都通過促進(jìn)多巴胺神經(jīng)元活動(dòng)而獲得獎(jiǎng)賞和強(qiáng)化效應(yīng)。為伏隔核多巴胺與動(dòng)物對(duì)環(huán)境刺激學(xué)習(xí)記憶形成的初期有關(guān)，給予多巴胺受體拮抗劑可降低動(dòng)物對(duì)環(huán)境的學(xué)習(xí)能力，但對(duì)已經(jīng)形成的記憶沒有影響。

本次全細(xì)胞膜片鉗研究表明，作用于伏隔核腦片時(shí)，D1 受體選擇性激動(dòng)劑SKF 38393 的作用表現(xiàn)出雙向性。在較低濃度（100 nmol/L）時(shí)，SKF 38393 可增加自發(fā)興奮性突觸后電流頻率，不改變其幅度；在較高濃度時(shí)（10 μmol/L）時(shí)，對(duì)自發(fā)興奮性突觸后電流頻率無明顯影響，而顯著升高其幅度。而進(jìn)一步對(duì)其10%～90%激活時(shí)間和衰減時(shí)間常數(shù)的分析表明，低濃度SKF 38393不改變這些參數(shù)，而高濃度SKF 38393 可使衰減時(shí)間常數(shù)顯著增加。綜合分析表明，在較低濃度條件下，多巴胺可作用于突觸前D1 受體，增加突觸前興奮性遞質(zhì)的釋放；而在較高濃度條件下，sEPSCs 頻率無顯著性改變，但有一定下降趨勢(shì)（表1，圖2C），這很可能是在此條件下，多巴胺對(duì)D1 受體的作用有增加和減少興奮性遞質(zhì)釋放的雙向性，其作用可相互抵消。但衰減時(shí)間常數(shù)顯著增加則表明藥物作用的短時(shí)間內(nèi)微小興奮性突觸后電流疊加在一起，這很可能是sEPSC 幅度大幅增加的原因之一。

本研究結(jié)果與Harvey 等［5］的報(bào)道不盡一致，他們的研究表明多巴胺可激活突觸前D1 受體而抑制誘發(fā)興奮性突觸后電流。這是因?yàn)椋旱谝?，他們將膜電壓鉗制在－80～－90 mV，而本研究鉗制在－75 mV。他們的實(shí)驗(yàn)鼠齡為4～5 周，本研究選用的實(shí)驗(yàn)鼠為生后17～32 天，基本相同。而根據(jù)趙妍君等［3］的研究表明，大鼠伏隔核神經(jīng)元出生后15～21 天與22～30 天的靜息膜電位分別為（－74 ± 9）mV 與（－73 ± 9）mV。鉗制電壓的不同可在一定程度上影響其電流的大小、離子進(jìn)出細(xì)胞膜的比例等。第二，Harvey 等只研究了10 μmol/L SKF 38393 的作用。本研究結(jié)果表明SKF 38393 的濃度大小會(huì)影響其作用效果。在高濃度條件下，D1 受體激動(dòng)劑的作用更加復(fù)雜。

綜上所述，隨著藥物濃度的變化，D1 受體選擇性激動(dòng)劑SKF 38393 對(duì)大鼠伏隔核棘狀神經(jīng)元自發(fā)興奮性突觸后電流的影響也發(fā)生改變，其對(duì)大鼠伏隔核棘狀神經(jīng)元谷氨酸受體介導(dǎo)的突觸傳遞起雙向的調(diào)節(jié)作用。其作用的復(fù)雜性也反映了多巴胺在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)獎(jiǎng)賞系統(tǒng)作用的復(fù)雜性，進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制的研究將有助于我們?cè)谛袨椤?dòng)機(jī)、獎(jiǎng)賞和毒品成癮等多種功能活動(dòng)與神經(jīng)精神疾病的藥物治療方面提供新的理論依據(jù)。

［1］ Ikemoto S. Brain reward circuitry beyond the mesolimbic dopamine system：a neurobiological theory［J］.Neurosci Biobehav Rev，2010，35（2）：129－150.

［2］ Morales M，Pickel V M. Insights to drug addiction derived from ultrastructural views of the mesocorticolimbic system［J］.Ann N Y Acad Sci，2012，1248：71－88.

［3］ 趙妍君，劉應(yīng)兵，陰正勤，等.大鼠發(fā)育過程中伏隔核神經(jīng)元的電生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特性［J］. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2004，20（1）：60－64.

［4］ Yawata S，Yamaguchi T，Danjo T，et al. Pathway－specific control of reward learning and its flexibility via selective dopamine receptors in the nucleus accumbens［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（31）：12764－12769.

［5］ Harvey J，Lacey M G.Endogenous and exogenous dopamine depress EPSCs in rat nucleus accumbens in vitro via D1 receptors activation［J］. J Physiol，1996，492（Pt 1）：143－154.

［6］ Liu Y W，Li J，Ye J H. Histamine regulates activities of neurons in the ventrolateral preoptic nucleus［J］. J Physiol，2010，588（Pt 21）：4103－4116.