西蘭花種子及其愈傷組織中蘿卜硫素含量比較

張品南，馬紹英，楊海榮，楊 柯，劉會(huì)杰，李 勝* ，周文政，付瑞軍

1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070;2 甘肅順意生物科技有限公司，張掖734000

西蘭花(Brassica oleracea L. var italica Plenck)屬十字花科蕓墓屬甘藍(lán)種，為一、二年生草本植物。西蘭花以頑強(qiáng)的生命力、不可替代的營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值、超乎食用價(jià)值被譽(yù)為“防癌［1］、抗癌［2］新秀”風(fēng)靡世界。日本的農(nóng)業(yè)研究院表示異硫代氰酸鹽能阻止黑色素癌細(xì)胞的生長［3］，其中蘿卜硫素是迄今為止蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌活力最強(qiáng)的一類異硫代氰酸鹽，它的抗癌作用已在大鼠的乳腺癌、皮膚中得到充分的證明［4］。近年來，從西蘭花種子、不同器官中提取蘿卜硫素的研究較廣［5］。

利用細(xì)胞和組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)植物次生物質(zhì)是藥物和一些工業(yè)原料的重要來源［6］。西蘭花(Brassica oleacea)為常見的蔬菜，從種子和花椰菜中提取蘿卜硫素具有成本高、含量低等缺點(diǎn)。利用細(xì)胞培養(yǎng)方法來生產(chǎn)，既可擺脫對(duì)植物資源的依賴，又能保護(hù)物種多樣性和生態(tài)環(huán)境［7］。

本實(shí)驗(yàn)以蘿卜硫素含量為考察指標(biāo)，采用高效液相色譜法，對(duì)市場(chǎng)供試的9 個(gè)品種及不同組織所誘導(dǎo)的愈傷中蘿卜硫素的含量進(jìn)行了測(cè)定，以期為西蘭花離體細(xì)胞系的代謝調(diào)控和資源合理利用等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試的9 種西蘭花種子由甘肅省農(nóng)科院種子公司提供，材料和品種名及編號(hào)見表1，萌發(fā)所得無菌苗葉片、胚軸及胚根誘導(dǎo)的愈傷組織為材料。所有愈傷組織在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)獲得。

1.2 試劑與儀器

蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品(90%，美國sigma 公司)、95%的乙醇(AR)、甲醇(HPLC)、二氯甲烷(AR)、乙腈(AR)。

培養(yǎng)基:MS +2. 0 mg/L 2，4-D +1. 0 mg/L 6-BA。

Aglient 1100 高效液相色譜儀:配有可變波長紫外檢測(cè)器和 Aglient 1100 色譜工作站，美國。AR2140 分析天平(奧斯豪上海公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE52CS-1);真空泵(中國浙江臨海市精工真空設(shè)備廠，L* 2-0.25 旋片式)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 愈傷組織的獲得

取14 d 苗齡的西蘭花無菌苗，切取子葉(約25 mm2)、胚軸(約5 mm2)和胚根(約5 mm2)接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)部位10 瓶，每瓶4 塊外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。以上培養(yǎng)基均添加30 g/L 蔗糖，4.5 g/L 瓊脂粉，用0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至5.8～6.0，高壓0.10～0.15 MPa，溫度121.0 ℃，滅菌20 min。培養(yǎng)溫度控制在(25 ±2)℃，黑暗下培養(yǎng)30 d。

1.3.2 蘿卜硫素樣品的制備

參照Bertelli 等［8］的制備及提取方法:取5 g 干燥材料(種子、愈傷組織)研缽研碎后，過60 目篩，準(zhǔn)確稱取0.5 g，倒入150 mL 的三角瓶中，加1 mL蒸餾水浸濕粉末室溫(25 °C)下放置12 h 并過夜，用鹽酸調(diào)pH 至3，然后冷凍干燥得到干燥的粉末，再加入10 mL 二氯甲烷浸提3 h，抽濾除去粉末，粉末再用10 mL 二氯甲烷浸提3 h，合并兩次二氯甲烷浸提液，濃縮并回收溶劑，45 °C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)旋轉(zhuǎn)濃縮，后用甲醇定容至4 mL。最后取提取樣液1 mL過0.22 μm 水系濾膜，冷凍保存待測(cè)［9］。

1.3.3 蘿卜硫素分析

1.3.3.1 HPLC 分析

色譜柱:VP-ODS(150 × 4.6 mm，10 μm);流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(水)=70∶30;流速:0.8 mL/min;柱溫:30 °C;檢測(cè)波長:245 nm;進(jìn)樣量:20 μL，每個(gè)濃度重復(fù)3 次;檢測(cè)靈敏度:0.02AUFS。蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖見圖1、圖2。

1.3.3.2 蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

采用外標(biāo)法定量，精確稱取10 mg 蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品，使用甲醇配制成濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋成濃度為500、250、125、62.5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。濃度由低至高依次進(jìn)樣，分別進(jìn)樣3 次，每次20 μL，在上述色譜條件下分析，以蘿卜硫素含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y=7.0575X+210.15，R2=0.9948。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同西蘭花種子中蘿卜硫素含量

由實(shí)驗(yàn)可知，供試的9 個(gè)西蘭花參試材料的種子中均檢測(cè)到蘿卜硫素(表1)，不同器官的愈傷組織中也全部檢測(cè)到蘿卜硫素，且不同西蘭花參試材料間、不同器官的愈傷組織中蘿卜硫素含量均存在極顯著差異(P ＜0.01)。經(jīng)差異顯著性分析得出，“玉皇”(香港黃清河有限公司中早生)是蘿卜硫素含量最高的西蘭花品種，其含量達(dá)942.758 μg/g，是其他品種的1.13～5.46 倍左右;含量最低的是“中青9 號(hào)”(172.808 μg/g)。

2.2 西蘭花不同器官愈傷組織中蘿卜硫素含量的比較

由表1 可見，不同材料不同器官獲得的愈傷組織中蘿卜硫素含量差異極顯著(P ＜ 0. 01)，“玉皇”子葉獲得的愈傷組織中蘿卜硫素含量最高，達(dá)到840.480 μg/g，分別是“綠冠早生”種子和子葉愈傷組織中(位居第二)的1.156 倍和1.36 倍。由此可見，“玉皇”子葉誘導(dǎo)所得的愈傷組織中蘿卜硫素含量是所有品種器官愈傷組織中含量最高的，并且與最低品種“中青9 號(hào)”相差達(dá)到6.48 倍。

表1 西蘭花種子及其愈傷組織中蘿卜硫素含量比較Table 1 Comparison of sulforaphane content in seeds of Broccoli species and callus induced from different organs (μg/g)

胚軸、胚根分別獲得愈傷組織中蘿卜硫素含量最高的仍然是“玉皇”，與最低的“中青9 號(hào)”相差達(dá)到8.18 倍和9.33 倍。胚根獲得愈傷組織中蘿卜硫素含量最低，其中“中青9 號(hào)”胚根中檢測(cè)出蘿卜硫素最低，為47.173 μg/g，說明西蘭花組織器官胚根誘導(dǎo)的愈傷組織不利于蘿卜硫素的大量提取。不同材料及各器官獲得愈傷組織中蘿卜硫素平均含量以種子最高，子葉，胚軸次之，胚根最低，種子中的平均含量分別為各器官愈傷組織平均含量的1.45、2.37和2.92 倍。

3 討論

研究認(rèn)為不同西蘭花材料間不同器官中均存在顯著影響蘿卜硫素含量的基因型差異。黃科等2008 研究發(fā)現(xiàn):青花菜新品種“福青1 號(hào)”為中晚熟一代雜種，蘿卜硫素含量高達(dá)984·47 μg/g［10］。前人在西蘭花種子中提取蘿卜硫素，是植物次生代謝物質(zhì)的成功經(jīng)驗(yàn)，為西蘭花細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生蘿卜硫素提供了參考。我們的試驗(yàn)結(jié)果表明:種子中蘿卜硫素含量942.758 μg/g 與其基本一致。但是在我國西蘭花種子匱乏，價(jià)格相對(duì)高昂，而且大部分需進(jìn)口。因此以西蘭花種子為材料進(jìn)行大量的蘿卜硫素提取成本太高，不能成為首選。在西蘭花菜、莖、葉廢棄物作為提取蘿卜硫素原料工業(yè)化生產(chǎn)已經(jīng)初見規(guī)模，但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求［11］。

經(jīng)本試驗(yàn)確立:以西蘭花愈傷組織為材料生產(chǎn)蘿卜硫素，是目前結(jié)合植物組織培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)代生物理論。選擇蘿卜硫素含量高的西蘭花愈傷組織進(jìn)行資源的深度開發(fā)利用有著廣闊的市場(chǎng)前景。

1 Iori R，Bernardi R，Gueyrard D，et al. Formation of glucoraphanin by chemoselective oxidation of natural glucoerucin:A chemo enzymatic route to sulforaphane. Bioorg Med Chem Let，1999，10:1047-1048.

2 Fowke JH，Longcope C，Hebert JR. Brassica vegetable consumption shifts estrogen metabolism in healthy postmenopausal women.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2000，9:773-779.

3 Magnusson C，Barron JA，Correia N，et al.Breast cancer risk following long-term oestrogen and oestrogen-progestin-replacement therapy.Int J Cancer，1999，81:339-344.

4 Li ZY(李志邈)，Cao JS(曹家樹).Anticancer properties of vegetable.Northern Horticul(北方園藝)，2001，4:4-6.

5 Su GY(蘇光耀). Separation and identification of sulforaphane hydrolyzed from glucosinolate in broccoli seed.Hanzhou:Dissertation Submitted to Zhejiang Gongshang University(浙江工商大學(xué))，MSc.2007.

6 Qi FH(齊鳳慧)，Zhan YG(詹亞光)，Jing TZ(景天忠).A review on elicitors and their regulation on secondary metabolites in plant cell culture.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2008，20:568-573.

7 Xue C(薛沖)，Li S(李勝)，Ma SY(馬紹英)，et al.Effects of different light qualities on the callus and its sulforaphen content from broccoli.J Gansu Agric Univ(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2010，45:95-99.

8 Bertelli D，Plessi M，Braghiroli D，et al.Separation by solidphase extraction and quantification by reverse phase HPLC of sulforaphane in broccoli.Food Chemistry，1998，63:417-421.

9 Matosheski NV，Wallig MA，Juvik JA，et al. Prarative HPLC method for the purification of sulforaphane and sulforaphane nitrile from Rassica oleracea. J Agric Food Chem，2001，49:1867-1872.

10 Huang K(黃科)，Wu QY(吳秋云)，Li B(李賓)，et al. A new broccoli cultivar‘Fu-qing 1’.Acta Horticul Sin(園藝學(xué)報(bào))，2008，35:1854.

11 Qiu HR(邱海榮). Determination and comparision of glucosinolate content in various broccoli and cauliflower cultivars.Nanjing:College of Horticulture Nanjing Agricultural University(南京農(nóng)業(yè)大學(xué))，MSc.2008.