蘿卜硫素通過下調Cox-2/Akt/GSK3β信號傳導抑制人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖

楊麗亞 劉彩玉

蘿卜硫素(sulforaphane)又稱“萊菔子素”，屬于異硫代氰酸鹽衍生物，廣泛存在于西蘭花、花椰菜、甘藍、蘿卜及芥菜等十字花科植物。藥理學研究發(fā)現，其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥及參與免疫調節(jié)等方面的功效[1-4]。對胃癌、結腸癌及肺癌等都有著較好的藥理活性[5-7]；腫瘤的發(fā)生發(fā)展與環(huán)氧化酶-2(COX-2)的高表達密切相關，人皮膚鱗狀細胞癌細胞中COX-2表達呈明顯升高的趨勢[8]。早期研究還提出COX-2的高表達還能誘導Akt/GSK3β信號傳導[9]，并且后者還參與人皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖、侵襲及遷移等生物學過程[10]。然而，目前關于蘿卜硫素是否通過調節(jié)Cox-2/Akt/GSK3β信號通路活化，進而抑制人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖的研究甚少。因此，本研究旨在觀察蘿卜硫素對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖及凋亡的影響，及蘿卜硫素對Cox-2/Akt/GSK3β信號通路的影響。

1 材料及方法

1.1 主要材料 人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞株購自武漢巴菲爾生物有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；CCK8試劑盒購自Solarbio公司；RIPA裂解液購自杭州四季青公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀；Annexin V/FITC細胞凋亡試劑盒購自北京四正柏生物公司；兔抗鼠Survivin、Casepase-3、Cox-2、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β及β-actin抗體購自美國CST公司；羊抗兔IgG二抗購自上海谷歌生物公司；ELC化學發(fā)光檢測試劑盒購自Advansta公司。

1.2 主要儀器 BIORAD-550型酶標儀(美國伯樂公司)；Amersham Imager 600儀器(BIO-RAD，美國)；FACSCalibur型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.3 A431細胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A431細胞，培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃恒溫。待細胞融合至90%左右，便進行傳代培養(yǎng)。具體操作步驟如下：PBS清洗細胞2遍，加入胰蛋白酶消化細胞，待細胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，轉移至無菌Ep管中，1000 r/min離心5 min，棄去舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 CCK8實驗 對數生長期的A431細胞接種至96孔板，每孔1×105個細胞，培養(yǎng)過夜后，加入不同濃度蘿卜硫素(0、30、60、120 μM)、順鉑(3 μM)及順鉑+蘿卜硫素(30、60、120 μM)處理細胞24 h。除去舊培養(yǎng)液，每孔加入20 μL CCK8試劑，放于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測450 nm波長處的細胞吸光度A值，并計算細胞相對存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 對數生長期的A431細胞接種至6孔板，每孔2×106個細胞，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度蘿卜硫素(0、30、60、120 μM)、順鉑(3 μM)及順鉑+60 μM蘿卜硫素處理細胞24 h。消化、離心、收集細胞，PBS清洗2次，離心后加入1×binding buffer制成細胞懸液，置于流式管，加Annexin V-FITC與PI 各5 μL，混勻后室溫下避光孵育15 min，再加入1×binding buffer充分混合細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 Western Blot檢測蛋白表達 按照“1.5”項操作進行藥物干預，收集細胞冰上充分裂解30 min，BCA法測定總蛋白濃度，每孔上樣50 μg進行凝膠電泳(恒壓70 V，3 h)，待蛋白完全分離后進行蛋白轉膜實驗(恒流275 mA，70 min)，5%脫脂牛奶封閉蛋白條帶1 h后，孵育一抗(Survivin、Casepase-3、Cox-2、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β及β-actin，稀釋比1∶1000)，4℃過夜，TBST洗膜3次，室溫孵育二抗90 min(稀釋比1∶3000)，TBST洗膜3次，ECL顯色，暗室曝光。蛋白灰度值采用Image J軟件進行分析。

1.7 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 CCK8法測定蘿卜硫素對A431細胞相對存活率的影響 低劑量(30 μM)蘿卜硫素組A431細胞吸光度A值與對照組相比沒有明顯差異(P>0.05)，其余蘿卜硫素組、順鉑組及順鉑+蘿卜硫素組的A值均顯著低于對照組(P<0.05)。順鉑+蘿卜硫素組的A值均顯著低于單純順鉑組(P<0.05)；順鉑+蘿卜硫素組的A值均顯著低于同劑量蘿卜硫素組(P<0.05)，見表1。

表1 不同組間A431細胞相對存活率比較

注：與對照組比較，1：P<0.05；與順鉑組比較，2：P<0.05；順鉑+蘿卜硫素組與同劑量蘿卜硫素組比較，3：P<0.05

2.2 蘿卜硫素對A431細胞凋亡率的影響 A431細胞凋亡率主要體現在早期凋亡(見圖2中右下象限)，對照組A431細胞凋亡率為(0.74±0.13)%，低、中、高劑量蘿卜硫素組A431細胞凋亡率分別為(1.31±0.15)%、(2.72±0.0.19)%、(3.86±0.34)%，單純順鉑組凋亡率為(5.46±0.49)%，順鉑+中劑量蘿卜硫素組凋亡率為(7.95±0.61)%；不同劑量蘿卜硫素組、單純順鉑組及順鉑+中劑量蘿卜硫素組A431細胞凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)；隨著蘿卜硫素濃度的升高，細胞凋亡率也隨之增高；順鉑+中劑量蘿卜硫素組的早期凋亡率顯著高于不同劑量蘿卜硫素組(P<0.05)。

圖1各組間A431細胞凋亡率的比較

2.3 蘿卜硫素對A431細胞中Survivin和Casepase-3蛋白表達的影響 蘿卜硫素對Survivin和Casepase-3蛋白表達的影響見表2、圖2。各蘿卜硫素組、順鉑組及順鉑+蘿卜硫素組中Survivin表達水平相對于對照組均顯著降低(P<0.05)，Caspase-3表達水平顯著升高(P<0.05)；隨著蘿卜硫素劑量的增高，Survivin表達水平顯著降低，Caspase-3表達水平顯著升高，各組間差異有統計學意義(P<0.05)；單純順鉑組Survivin表達量顯著低于各蘿卜硫素組，Caspase-3表達顯著高于各蘿卜硫素組(P<0.05)；順鉑+蘿卜硫素組的Survivin表達顯著高于各蘿卜硫素和單純順鉑組(P<0.05)。

表2 各組間Survivin和Casepase-3蛋白表達水平的比較

注：與對照組比較，1：P<0.05；與順鉑組比較，2：P<0.05；順鉑+蘿卜硫素組與同劑量蘿卜硫素組比較，3：P<0.05。

注：1：對照組，2：低劑量蘿卜硫素組，3：中劑量蘿卜硫素組，4：高劑量蘿卜硫素組，5：單純順鉑組，6：順鉑+中劑量蘿卜硫素組。

圖2蘿卜硫素對A431細胞中Survivin和Casepase-3蛋白表達的影響

2.4 蘿卜硫素對A431細胞中Cox-2/Akt/GSK3β信號通路的影響 蘿卜硫素對Cox-2/Akt/GSK3β信號通路蛋白表達的影響見表3、圖3。各蘿卜硫素組、順鉑組及順鉑+蘿卜硫素組中Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表達水平相比于對照組均顯著降低(P<0.05)；隨著蘿卜硫素劑量的增高，Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表達水平顯著降低，各組間差異有統計學意義(P<0.05)；單純順鉑組Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表達量顯著低于各蘿卜硫素組(P<0.05)；順鉑+蘿卜硫素組的Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表達顯著低于各蘿卜硫素和單純順鉑組(P<0.05)。

表3 各組間Cox-2/Akt/GSK3β信號通路蛋白表達水平的比較

注：與對照組比較，1：P<0.05；與順鉑組比較，2：P<0.05；順鉑+蘿卜硫素組與同劑量蘿卜硫素組比較，3：P<0.05

注：1：對照組，2：低劑量蘿卜硫素組，3：中劑量蘿卜硫素組，4：高劑量蘿卜硫素組，5：單純順鉑組，6：順鉑+中劑量蘿卜硫素組。

圖3蘿卜硫素對A431細胞中Cox-2/Akt/GSK3β信號通路的影響

3 討論

蘿卜硫素來源于十字花科植物，具有較強的抗腫瘤活性[5-7]。除此之外，蘿卜硫素對多種皮膚性疾病有著較好的藥理作用[11,12]，而對于人皮膚鱗狀細胞癌的輔助治療是否具有潛在價值，需進一步研究。因此，本實驗以人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞為體外研究模型，觀察了蘿卜硫素對A431細胞增殖、凋亡的影響，并初步探討了其作用機制。腫瘤發(fā)病機制不僅與癌細胞增殖、分化異常相關，還與細胞凋亡受阻有關。因此，阻滯腫瘤細胞增殖、誘導其凋亡可能是防治癌癥的主要手段[13]。已有研究證實，蘿卜硫素可通過誘導癌細胞凋亡、抑制細胞DNA合成、提升機體細胞免疫力等方面起著抗腫瘤的功效[14]。

細胞凋亡由基因調控的細胞自主程序性死亡，多種基因活化可調節(jié)此生物學效應。凋亡途徑包含死亡受體途徑及線粒體途徑，它們均能引起效應性Caspase-3活化，進而導致內切核酸酶激活，誘導細胞凋亡發(fā)生[15,16]。Caspase是調控細胞凋亡的主要蛋白，而Survivin蛋白屬于抑制凋亡蛋白，主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7活性阻斷細胞凋亡，并且上述蛋白表達水平與人皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖、凋亡相關密切[17,18]。

以A431細胞增殖、凋亡為切入點，進一步觀察蘿卜硫素作用的分子機制。CCK8法實驗結果提示，蘿卜硫素呈濃度依賴性抑制A431細胞增殖，然而，不同劑量蘿卜硫素對A431細胞的生長抑制作用不及單純順鉑和順鉑+蘿卜硫素組，二者表現出協同作用。細胞凋亡實驗結果提示，不同劑量蘿卜硫素組、單純順鉑組和順鉑+蘿卜硫素組均能引發(fā)A431細胞的早期凋亡，并且細胞早期凋亡率與蘿卜硫素劑量呈明顯正相關，順鉑+蘿卜硫素聯合給藥引起的細胞凋亡高于單純蘿卜硫素組和單純順鉑組，二者聯合用藥有協同作用。Western Blot實驗顯示蘿卜硫素、順鉑及聯合給藥能顯著降低Survivin蛋白表達量，誘導Caspase-3蛋白表達。

Cox-2在人皮膚鱗狀細胞癌細胞中呈高表達狀態(tài)[10]，早期研究已證實Cox-2可誘導Akt磷酸化[20]，進一步促使GSK-3β磷酸化[12]，該信號傳導的激活能調節(jié)細胞增殖、黏附、分化及凋亡等過程。本文研究也發(fā)現不同劑量蘿卜硫素組、單純順鉑組和順鉑+蘿卜硫素組均能顯著抑制Cox-2、p-Akt及p-GSK-3β表達，并且Cox-2、p-Akt及p-GSK-3β表達量與蘿卜硫素劑量呈明顯正相關，順鉑+蘿卜硫素聯合給藥抑制作用明顯高于單純蘿卜硫素和單純順鉑組，二者聯合用藥有協同作用。

綜上所述，蘿卜硫素可通過誘導人皮膚鱗狀細胞癌細胞凋亡、抑制其增殖起著抗癌的活性，該生物學效應可能與抑制Cox-2/Ak/GSK-3β信號傳導、上調Caspase-3及下調Survivin蛋白表達相關。