RNA 結(jié)合蛋白HuR 對(duì)NF-κB 抑制因子α轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的初步研究*

于文燕， 馬小娟， 孫宏衛(wèi)， 買買提祖農(nóng)·買蘇爾， 馬瑞斌， 柯 穎， 劉玉新， 馬 琪

(新疆醫(yī)科大學(xué)1病理生理學(xué)教研室，6機(jī)能中心，新疆 烏魯木齊830000;2南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州510515;武警新疆總隊(duì)醫(yī)院3普外科，4神經(jīng)外科，新疆 烏魯木齊830000;5寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)教研室，浙江 寧波315000)

RNA 結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學(xué)作用的分子家族，其中HuR 屬于胚胎致死異常視覺家族的RBPs，在體內(nèi)表達(dá)廣泛。最初發(fā)現(xiàn)HuR 與神經(jīng)分化相關(guān)，通過與靶mRNA 3'UTR 的ARE 結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RNA 的穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)。近年發(fā)現(xiàn)，HuR 與細(xì)胞增殖、炎癥等密切相關(guān)［1-3］。IκB 是核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的抑制因子，是細(xì)胞漿中存在的另一類蛋白質(zhì)家族。IκB 的 主 要 作 用可以概括 如下［4］:阻止NF-κB 核易位、阻止NF-κB 與DNA 結(jié)合、促進(jìn)NF-κB 與DNA 的κB 序列解離?？梢奍κB 對(duì)于NF-κB 發(fā)揮其正常生物學(xué)功能至關(guān)重要。本研究主要是從轉(zhuǎn)錄后水平研究HuR 對(duì)IκB-α在體內(nèi)的調(diào)控，為進(jìn)一步研究IκB-α 在NF-κB 通路調(diào)控中的作用打下基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞系

NIH 3T3 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物種庫(kù)(American Type Culture Collection，ATCC)。

2 主要試劑

培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、無血清培養(yǎng)基(Opti-MEM)購(gòu)自Gibco-BRL;質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA 純化回收試劑盒、100 bp DNA marker、1 kb DNA marker 和預(yù)染蛋白ladder 均購(gòu)自New England Biolabs(NEB);瓊脂糖粉購(gòu)自Biowest;LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn) 染 試 劑、Platinum ?SYBR? Green Real-time PCR 試劑盒和TRIzol RNA提取試劑購(gòu)自Invitrogen;ReverTra Ace? qPCR RT Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNA 純化試劑盒購(gòu)自Toyobo;限制性內(nèi)切酶、KOD plus 聚合酶及配套PCR 試劑、T4 DNA 連接酶及配套試劑購(gòu)自TaKaRa;MAXIscript Kit 購(gòu) 自Ambion;Streptavidin Agarose Resin 購(gòu) 自Thermo;酵母RNA 購(gòu)自Sigma;anti-HA、anti-HuR 和anti-IκB-α 抗體購(gòu)自Santa Cruz;HRP-linked Antibody購(gòu)自Cell Signaling Technology;放線菌素D 和Dual-Luciferase Reporter Gene Assay Kit 購(gòu)自Promega。

3 質(zhì)粒、引物合成及siRNA 合成

螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-control、海腎(Renilla)螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pRL-TK、表達(dá)pcDNA3-HA-HuR 融合蛋白的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HA-HuR 和pcDNA3 空載體由寧波大學(xué)劉玉新博士惠贈(zèng);引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成;siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

4 主要方法

4.1 IκB-α mRNA 3'UTR 報(bào)告基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 使用細(xì)胞總RNA 提取試劑TRIzol 提取NIH 3T3 細(xì)胞總RNA，以此總RNA 為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，獲得的產(chǎn)物即為NIH 3T3 細(xì)胞cDNA 文庫(kù)。從GenBank 獲得小鼠IκB-α mRNA 3'UTR 的編碼序列，并設(shè)計(jì)引物。上游引物5'-ATC GCC GTG TAA TGG AAA GTG GCA AAA AGA ATG-3'，下游引物5'-GCT CTA GAG CTG TCT GTA AAA ATC TGT TTA AT-3'(下劃線部分為Xba I 酶切位點(diǎn))。以NIH 3T3 細(xì)胞的cDNA 文庫(kù)為模板，使用KOD plus 聚合酶進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增IκB-α mRNA 3'UTR 片段。同時(shí)從pGL3-control 質(zhì)粒擴(kuò)增luciferase 片段使用的上游引物5'-GGT AAA GCC ACC ATG GAA GAC G-3'(下劃線部分為 Nco I 的酶切位點(diǎn))，下游引物5'-CACTTTCCA TTA CAC GGC GAT CTT TCC G-3'。將2 次PCR 擴(kuò)增的片段混合后為模板，擴(kuò)增luciferase-IκB-α mRNA 3'UTR 片 段，5'-GGT AAA GCC ACC ATG GAA GAC G-3'(下劃線部分為Nco I 的酶切位點(diǎn))，下游引物5'-GCT CTA GAG CTG TCT GTA AAA ATC TGT TTA AT-3'(下劃線部分為Xba I 酶切位點(diǎn))。將luciferase-UTR 的PCR 產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶后用DNA 純化回收試劑盒回收。將pGL3-control 質(zhì)粒以及回收的luciferase-UTR片段分別行Xba I 和Nco I 雙酶切，將luciferase-IκBα mRNA 3'UTR 通過Xba I 和Nco I 酶切位點(diǎn)插入pGL3-control 以取代質(zhì)粒中原有的螢火蟲螢光素酶基因;酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶后用DNA 純化回收試劑盒回收?；厥盏拿盖泻筝d體與目的片段按摩爾比1∶4 混合，用T4 DNA 連接酶于16 ℃連接16 h，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，鋪Amp+瓊脂板，12 h 后挑取單克隆，置于5 mL 的Amp+LB 培養(yǎng)液中搖菌12 h，使用質(zhì)粒微提試劑盒提取質(zhì)粒。對(duì)所提取的質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR、Xba I 和Nco I 雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定，所構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pGL3-UTR。

4.2 脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染前一天接種3T3 細(xì)胞于6 cm 皿，次日融合度約60%左右。每1 μg 質(zhì)粒按照3 μL 脂質(zhì)體計(jì)算，分別用無血清培養(yǎng)基Opti-MEM 50 μL 稀釋質(zhì)粒及脂質(zhì)體，室溫孵育5 min。將稀釋后的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑加入質(zhì)粒中，混勻離心，室溫孵育15 min。細(xì)胞換液，加入無血清DMEM 900 μL。將質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物加入細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)3 h。3 h 后補(bǔ)液至4 mL 并補(bǔ)充10%血清。

4.3 過表達(dá)HuR 對(duì)IκB-α mRNA 穩(wěn)定性及蛋白表達(dá)影響 3.5 cm 皿NIH 3T3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3-HAHuR 1 μg，對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3 1 μg 24 h 后，給予放線菌素D 5 mg/L 處理1 h。放線菌素D 可以抑制RNA 的合成，從而檢測(cè)RNA 的穩(wěn)定性。提取mRNA檢測(cè)IκB-α mRNA 變化;6 cm 皿NIH 3T3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-HuR 1 μg，對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3 1 μg 24 h 后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，Western blotting 檢測(cè)IκB-α 蛋白表達(dá)變化。

4.4 報(bào)告基因檢測(cè) 雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，即結(jié)合螢火蟲螢光素酶底物和海腎螢光素酶底物共報(bào)告基因測(cè)試技術(shù)，在用螢火蟲螢光素酶(pGL3)定量基因表達(dá)時(shí)，通常采用海腎螢光素酶(pRL-TK)底物共報(bào)告基因作為內(nèi)參照，來減少內(nèi)在的變化因素所帶來的的實(shí)驗(yàn)的誤差，如排除培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別，以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解效率的差別等。按照Dual-Luciferase Reporter Gene Assay Kit 說明書操作，將試劑盒中的專用細(xì)胞裂解液(5 ×passive lysis)用PBS 稀釋為1 ×passive lysis。轉(zhuǎn)染后的24 孔板3T3 細(xì)胞，每孔加入150 μL 1 ×passive lysis，室溫?fù)u床裂解15 min。吸取裂解產(chǎn)物于新離心管，凍存于－80 ℃冰箱30 min。將上清恢復(fù)至室溫后混勻，吸5 μL 上清，按照Dual-Luciferase Reporter Gene Assay Kit 說明進(jìn)行報(bào)告基因活性檢測(cè)。

4.5 制備biotin 標(biāo)記的IκB-α 與GAPDH mRNA 3'UTR 探針 對(duì)照組以GAPDH 3'UTR 為模版，實(shí)驗(yàn)組以質(zhì)粒pGL3-UTR 為模板擴(kuò)增帶有T7 promoter 的單鏈DNA 序列，以作為下一步進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的模板DNA，用DNA 回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物。以上述單鏈3'UTR 序列為模板按照MAXIscript Kit 說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，得到biotin 標(biāo)記的IκB-α mRNA 3'UTR 的探針。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，于反應(yīng)液中加入RNase-free DNase 10 U，混勻后置于37 ℃水浴反應(yīng)10 min，使模板DNA 充分降解。使用RNeasy?Kit 對(duì)體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA biotin-3'UTR 探針進(jìn)行純化。純化得到的RNA 探針進(jìn)行濃度測(cè)定，凍于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

4.6 Streptavidin-biotin RNA-pull down 待3T3 細(xì)胞的融合度達(dá)到90%時(shí)，用細(xì)胞刮刀刮下6 cm 皿內(nèi)的細(xì)胞，用1 mL 預(yù)冷PBS 沖洗細(xì)胞刮刀和6 cm 皿，收集懸液置于EP 管內(nèi)，以上操作均在冰上完成。12 000 ×g 4 ℃離心30 s 得到細(xì)胞沉淀，棄上清，加入300 μL 細(xì)胞裂解液(1. 5 g/L 肝素、2 mmol/L DTT、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑)于4 ℃裂解細(xì)胞1 h。細(xì)胞裂解液以12 000 ×g 4 ℃離心10 min，收集裂解上清于DEPC 處理過無RNase 酶的EP 管內(nèi)。裂解上清中加入biotin 標(biāo)記的3'UTR 探針(約400 ng)、酵母RNA(100 μg/L，1.5 μL)、RNase inhibitor(1 ×105U/L，3 μL)、肝素(1.5 g/L)，4 ℃共孵育3 h。取20 μL 鏈親和素標(biāo)記的beads 置于無RNase 的EP 管內(nèi)，用細(xì)胞裂解液500 μL 洗滌streptavidin beads，500 ×g 4 ℃離心5 min，棄上清，備用。探針與裂解液共孵育3 h 后，12 000 ×g 4 ℃離心5 s 后，轉(zhuǎn)移至預(yù)先洗滌過的beads 中，4 ℃共孵育3 h。上述共孵育3 h 后混合溶液用750 μL 細(xì)胞裂解液洗滌，以洗掉beads 上結(jié)合的非特異蛋白。500 ×g 4 ℃離心5 min，棄上清。重復(fù)清洗beads 4 次。洗滌beads 4 次后，加入2 × Loading Buffer 20 μL 95 ℃變性5 min，12 000 r/min 離心3 min，用于Western blotting檢測(cè)。

4.7 脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染干擾片段siRNA 轉(zhuǎn)染前1 d 接種3T3 細(xì)胞于3.5 cm 皿，次日融合度約30%左右。將公司合成的3 對(duì)干擾HuR 的siRNA(序列見表1)按照濃度1∶1∶1 混合，混勻后按照siNC、siHuR 25 nmol/L 及3 μL 脂質(zhì)體計(jì)算，分別用無血清培養(yǎng)基Opti-MEM 50 μL 稀釋siRNA 及脂質(zhì)體，室溫孵育5 min。將稀釋后的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑加入siRNA 中，混勻離心，室溫孵育15 min。細(xì)胞換液，加入無血清DMEM 600 μL 將質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物加入細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)6 h。6 h 后補(bǔ)液至4 mL 并補(bǔ)充10%血清。

表1 HuR siRNA 的序列Table 1. Sequences of HuR siRNA

4.8 干擾HuR 表達(dá)對(duì)IκB-α mRNA 及蛋白表達(dá)影響 3.5 cm 皿NIH 3T3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染HuR siRNA 24 h后，將其傳代，平分為2 皿，1 皿用于檢測(cè)HuR 及IκB-α mRNA 表達(dá)，另1 皿給予放線菌素D 處理1 h，提取mRNA 檢測(cè)IκB-α mRNA 穩(wěn)定性改變。6 cm 皿NIH 3T3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染HuR siRNA 48 h 后，裂解細(xì)胞，Western blotting 檢測(cè)HuR 及IκB-α 蛋白表達(dá)。

4.9 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)mRNA 穩(wěn)定性 過表達(dá)或干擾HuR 表達(dá)處理后的3T3 細(xì)胞給予放線菌素D 5 mg/L 處理1 h，TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，RNA 反轉(zhuǎn)錄按照ReverTra Ace? qPCR RT Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)體系按照Platinum? SYBR? Green Real-time PCR 試劑盒說明書進(jìn)行配制及操作，以β-actin 作為內(nèi)參照。引物序列見表2。

表2 qPCR 的引物序列Table 2. Primer sequences for qPCR

5 灰度分析

使用ImageJ 灰度分析軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡圖像灰度分析，分別測(cè)定出各個(gè)時(shí)點(diǎn)蛋白表達(dá)量的灰度值及相對(duì)應(yīng)actin 蛋白表達(dá)量的灰度值，二者的比值代表各時(shí)點(diǎn)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，并以相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 13.0，首先采用Levene 進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，文中樣本方差均齊，則采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繪圖軟件為OriginPro 8.0。

結(jié) 果

1 IκB-α mRNA 3'UTR 報(bào)告基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

將提取的質(zhì)粒pGL3-UTR 分別用Nco I 和Xba I進(jìn)行雙酶切鑒定。電泳結(jié)果表明，經(jīng)雙酶切后可得到約3.6 kb 和2.2 kb 的片段，符合預(yù)期大小，見圖1。DNA 測(cè)序結(jié)果同時(shí)證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2 IκB-α mRNA 3'UTR 驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的表達(dá)

陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGL3-control 1 μg 和pRL-TK 0.1 μg;實(shí)驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGL3-UTR 1 μg和pRL-TK 0.1 μg。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別在轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒24 h 后檢測(cè)報(bào)告基因螢光素酶活性，與對(duì)照組相比，過表達(dá)pGL3-UTR 后，報(bào)告基因螢光素酶活性明顯增高，見圖2。

Figure 1. Identification of vector pGL3-UTR with restrictive endonuclease digestion.M:1 kb DNA marker;1:pGL3-UTR;2:pGL3-UTR digested by Nco I and Xba I.圖1 pGL3-UTR 螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒的鑒定

Figure 2. The influence of overexpressing pGL3-UTR on the luciferase activity of IκB-α mRNA 3'UTR reporter gene.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs pGL3-control.圖2 過表達(dá)pGL3-UTR 對(duì)IκB-α mRNA 3'UTR 報(bào)告基因螢光素酶活性的影響

3 HuR 蛋白對(duì)IκB-α mRNA 3'UTR 驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因螢光素酶活性的影響

陰性對(duì)照:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGL3-UTR 1 μg、pRL-TK 0.1 μg 和pcDNA3 1 μg;實(shí)驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGL3-UTR 1 μg、pRL-TK 0. 1 μg 和pcDNA3-HA-HuR 1 μg。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒24 h后檢測(cè)，與對(duì)照組相比，過表達(dá)pcDNA3-HA-HuR 后，報(bào)告基因螢光素酶活性明顯增高，見圖3。

Figure 3. The influence of overexpressing pcDNA3-HA-HuR on the IκB-α mRNA 3'UTR reporter gene. Mean ±SD. n=3. * P ＜0.05 vs pcDNA3.圖3 過表達(dá)pcDNA3-HA-HuR 對(duì)IκB-α mRNA 3'UTR 報(bào)告基因螢光素酶活性的影響

4 Streptavidin-biotin RNA-pull down 技術(shù)證明HuR 蛋白可與IκB-α mRNA 3'UTR 特異性結(jié)合

Streptavidin-biotin RNA-pull down 后，biotin-IκBα 3'UTR RNA 探針組可以檢測(cè)到HuR 蛋白，而biotin-GADPH 3'UTR RNA 探針組為陰性，表明HuR 蛋白可以特異性地與IκB-α 3'UTR RNA 結(jié)合，見圖4。

Figure 4. The result of RNA pull-down assay.圖4 RNA pull-down 結(jié)果

5 過表達(dá)HuR 對(duì)IκB-α mRNA 穩(wěn)定性及蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照相比，過表達(dá)pcDNA3-HA-HuR 后，IκB-α mRNA 穩(wěn)定性無明顯變化，見圖5，IκB-α 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，見圖6。

Figure 5. The influence on IκB-α mRNA stability by overexpressing pcDNA3-HA-HuR. Mean±SD.n=3.圖5 過表達(dá)pcDNA3-HA-HuR 對(duì)IκB-α mRNA 穩(wěn)定性的影響

Figure 6. The influence on IκB-α protein by overexpressing pcDNA3-HA-HuR.Mean±SD. n =3. * P ＜0.05 vs pcDNA3.圖6 過表達(dá)pcDNA3-HA-HuR 對(duì)IκB-α 蛋白表達(dá)的影響

6 干擾HuR 表達(dá)后觀察其對(duì)IκB-α mRNA 穩(wěn)定性及蛋白表達(dá)的影響

qPCR 檢測(cè)HuR mRNA 表達(dá)干擾效率約80%，干擾HuR mRNA 后對(duì)IκB-α mRNA 穩(wěn)定性無明顯影響，見圖7。HuR 蛋白表達(dá)明顯被干擾后，IκB-α 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，見圖8。

討 論

核因子κB 抑制蛋白是核因子κB 的抑制因子。IκB 蛋白家族與Rel/NF-κ 蛋白家族一樣，也是一個(gè)大家族，它們都來源于相同祖先NF-κB/IκB 超家族的Rel 同源區(qū)－ 錨蛋白重復(fù)序列區(qū)(Rel homology domain-ankyrin repeat domain，RHD-ARD)結(jié) 構(gòu)［5］。IκB 蛋白家族的成員主要包括:IκBα、IκBβ、IκBε、Bcl-3、IκBγ、IκBδ、p100 和p105 等。

在一般的生理情況下，非活化狀態(tài)的NF-κB 以與IκBα 聚合的三聚體形式或與前體蛋白聚合的二聚體形式存在于胞漿中，此時(shí)NF-κ B 的Rel 同源區(qū)均被IκB 占據(jù)，遮蓋了NF-κB 的核定位序列(nuclear localization signal，NLS)，因而NF-κB 不能轉(zhuǎn)位入核，不能調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)，處于無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到合適的胞外信號(hào)前炎癥細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α 以及低氧、氧化劑、脂多糖、細(xì)菌、病毒、紫外線、某些變應(yīng)原等多種因素的刺激時(shí)，引起一系列連鎖的酶促反應(yīng)。當(dāng)IκB 被蛋白酶體降解后，IκB 與NF-κB 的RHD 區(qū)分離，NF-κB 的NLS 暴露出來，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因上的κB 位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯［6］。

由此可見IκBα 對(duì)于核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 發(fā)揮其正常功能具有重大意義，本研究從轉(zhuǎn)錄后水平探討體內(nèi)調(diào)控IκBα 生物學(xué)功能的機(jī)制，從而為進(jìn)一步研究其在NF-κB 通路中的作用機(jī)制打下良好基礎(chǔ)。

Figure 7. The influence on the IκB-α mRNA stability by interfering HuR.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs siNC.圖7 HuR 干擾效率檢測(cè)及對(duì)IκB-α mRNA 穩(wěn)定性的影響

Figure 8. The influence on the IκB-α protein by interfering HuR.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs siNC.圖8 HuR 干擾效率檢測(cè)及對(duì)IκB-α 蛋白表達(dá)的影響

基因表達(dá)調(diào)控是在多級(jí)水平上進(jìn)行的:基因活化、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工等［7］。基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是大多數(shù)基因的主要調(diào)控形式，但是其它的調(diào)控能夠在從DNA 到蛋白質(zhì)途徑發(fā)揮作用，來調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的基因產(chǎn)物數(shù)量。基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控一般指在RNA 聚合酶結(jié)合到基因啟動(dòng)子后，對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行的一系列修飾，主要包括:轉(zhuǎn)錄的提前終止、剪接、mRNA 通過核孔和胞質(zhì)內(nèi)定位、RNA 編輯、翻譯起始和翻譯效率，mRNA 的穩(wěn)定性等多個(gè)環(huán)節(jié)。

轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制比其它調(diào)節(jié)形式更快捷和經(jīng)濟(jì)［8］，可以根據(jù)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的變化迅速調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，對(duì)于機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。在基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中，mRNA 穩(wěn)定性及翻譯的調(diào)控具有重要的作用［9-12］，通過這兩種形式的調(diào)控，細(xì)胞可以對(duì)內(nèi)外源性刺激作出迅速的反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本中調(diào)控mRNA 穩(wěn)定性等的元件存在于3'非翻譯區(qū)(3'UTR)［13］，大部分轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的靶向部位都位于轉(zhuǎn)錄本mRNA 的3'UTR 區(qū)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)約5% ～8%的人類基因編碼的mRNA 其3'UTR區(qū)含有ARE 序列。ARE 序列是一段長(zhǎng)度約為50 ～150 nt、富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列，與mRNA 的穩(wěn)定性有密切關(guān)系。ARE 序列能夠招募許多ARE 結(jié)合蛋白(ARE-binding proteins，ARE-BP)，這些AREBP 相互協(xié)作或競(jìng)爭(zhēng)地與mRNA 的ARE 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，共同調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯水平。

Hu 家族蛋白是一種mRNA 結(jié)合蛋白［14］，因與果蠅體內(nèi)的胚胎致死異常視覺蛋白同源，所以Hu 家族又被稱為類胚胎致死異常視覺(ELAVL)家族。Hu 家族有4 個(gè)成員:HuB(Hel-N1)、HuC、HuD 和HuR(ELAVLl)，前3 個(gè)成員主要在終端分化的神經(jīng)組織表達(dá)并與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)，而HuR 在其它組織中也廣泛表達(dá)。在HuR 蛋白上有3 個(gè)RNA 識(shí)別模序(RNA recognition motif，RRMs)，可以與ARE(AUrich element)特定位點(diǎn)結(jié)合。

近年來研究發(fā)現(xiàn)HuR 在P13K/Akt/NF-κB、p38 MAPK、Wnt 等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中或應(yīng)激、低氧條件啟動(dòng)下穿過細(xì)胞核到達(dá)細(xì)胞漿，在胞漿中穩(wěn)定mRNA 減少其降解，延緩mRNA 半衰期，而加強(qiáng)靶因子的翻譯表達(dá)［15］。

本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了IκB-α mRNA 3'UTR 報(bào)告基因真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告基因，與對(duì)照組相比，其報(bào)告基因數(shù)值明顯增高，表明IκB-α mRNA的3'UTR 區(qū)在其發(fā)揮生物學(xué)功能中具有重要作用;將RNA 結(jié)合蛋白HuR 的真核表達(dá)質(zhì)粒與IκB-α mRNA 3'UTR 報(bào)告基因真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè)，其報(bào)告基因與對(duì)照組相比數(shù)值明顯增高，表明HuR 可以對(duì)IκB-α mRNA 3'UTR 的生物學(xué)功能進(jìn)行調(diào)控。體外標(biāo)記IκB-α mRNA 3'UTR 生物素探針及RNA pull-down 實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)HuR 可以與IκB-α mRNA 3'UTR 特異性結(jié)合而發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。

為進(jìn)一步研究HuR 對(duì)IκB-α 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，在細(xì)胞中分別過表達(dá)及干擾HuR，以觀察其對(duì)IκB-α mRNA 穩(wěn)定性及蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示分別過表達(dá)及干擾HuR 后，對(duì)IκB-α mRNA 穩(wěn)定性影響不大，但I(xiàn)κB-α 蛋白表達(dá)分別出現(xiàn)上調(diào)及下調(diào)現(xiàn)象，說明HuR 對(duì)IκB-α 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，主要是通過加強(qiáng)其翻譯作用而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究中證實(shí)RNA 結(jié)合蛋白HuR 可以與IκB-α mRNA 3'UTR 特異性結(jié)合，并通過加強(qiáng)IκB-α 的翻譯來調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能，為進(jìn)一步研究其在NF-κ 通路中發(fā)揮的重要作用提供了理論依據(jù)。

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