青島啤酒酵母與高濃酵母篩選高濃釀造酵母融合親株100L發(fā)酵分析

易慶平，李居寧

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000）

啤酒質(zhì)量的關(guān)鍵是發(fā)酵菌種，酵母是啤酒的靈魂[1]。酵母菌種的優(yōu)化、培育、篩選工作都被啤酒生產(chǎn)廠家放在非常重要的位置。選育一株耐高酒精度、耐高糖度、高滲透壓，同時(shí)分泌良好風(fēng)味物質(zhì)的酵母菌是高濃釀造啤酒的核心工作。國(guó)外部分研究者利用酵母融合技術(shù)選育釀酒菌種，取得了較理想的效果[2]。通過(guò)原生質(zhì)體融合，得到的菌株遺傳了親本的許多優(yōu)良性狀，啤酒酵母原生質(zhì)體融合菌株在實(shí)驗(yàn)室的研究較多[3-9]，工業(yè)上的應(yīng)用鮮有報(bào)道[9-11]。在啤酒釀造中，菌種代謝產(chǎn)生的酶催化一系列生化反應(yīng)產(chǎn)生的雙乙酰、乙醛和高級(jí)醇等物質(zhì)會(huì)影響啤酒口感及質(zhì)量。本研究以選育優(yōu)良的啤酒高濃釀造生產(chǎn)菌株為目的，篩選出發(fā)酵度較高、雙乙酰還原快、凝絮性較好、風(fēng)味較好的酵母菌株為原生質(zhì)體融合的親株，為下一步原生質(zhì)體融合提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米（粳米）、酒花、α-淀粉酶等酶制劑、乳酸、石膏 青島啤酒五公司；澳大利亞大麥芽、加拿大大麥芽 青島啤酒麥芽廠；自行研制大麥復(fù)合糖漿 大麥70%+玉米25%+5%麥芽，根據(jù)青島啤啤酒酵母菌種庫(kù)的檔案數(shù)據(jù)，從中挑選S.cerevisiae屬中的優(yōu)質(zhì)的青島啤酒酵母和酒精酵母通過(guò)糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、離子抗性實(shí)驗(yàn)、二氧化碳減重實(shí)驗(yàn)、供試菌株發(fā)酵后風(fēng)味物質(zhì)分析及品評(píng)，確定以下菌株作為融合親株，見表1。

751分光光度計(jì) 上海分光光度計(jì)廠；電子天平、分析天平、制冰機(jī)、紫外分光光度計(jì) 上海儀器有限公司；啤酒全自動(dòng)分析儀（Anton Paar）、酸度計(jì)、100L發(fā)酵罐 哈爾濱漢德釀造設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 主要分析方法

發(fā)酵度測(cè)定：參考文獻(xiàn)[12]的方法；細(xì)胞的凝聚性的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[13]的方法；雙乙酰含量的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[12]的方法；α-氨基氮的測(cè)定[14]：茚三酮法。

1.3 操作要點(diǎn)

1.3.1 糖化工藝 糖化工藝的設(shè)計(jì)原則在遵循青島啤酒的生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上提高原麥汁濃度到15°P，具體配方及工藝見表2。

表1 供試菌株一覽表Table 1 The list of test strains

表2 糖化配方Table 2 Glycosylated formula

1.3.2 糖化工藝 糖化工藝的設(shè)計(jì)原則遵循青島啤酒的生產(chǎn)工藝，在此基礎(chǔ)上提高原麥汁濃度到15°P，糖化鍋中澳大利亞大麥與加拿大大麥1∶1配比，糊化鍋中投入25%的粳米，酒花分三次添加，總加入量為0.06%。糖化工藝為：50℃糖化30min，65℃糖化60min，75℃糖化15min，糖化曲線見圖1。

圖1 糖化工藝曲線Fig.1 The curve of saccharification process

1.3.4 發(fā)酵工藝 麥汁冷卻至（8.0±0.5）℃時(shí)進(jìn)罐，滿罐后24h內(nèi)排渣一次；待麥汁自然升溫至9.0～9.5℃發(fā)酵；發(fā)酵待糖度降至4.8～5.2°Bx，升溫至12℃，還原雙乙酰；繼續(xù)糖度降至3.8～4.2°Bx，保持罐壓0.8～1.0kg/cm2，封罐24～48h回收酵母，以后每2d排一次酵母；雙乙酰降至0.05mg/L時(shí)降溫，溫度降至0℃后貯藏7d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

糖化生產(chǎn)15°P麥汁，分別用供試菌株T1、T2、T3、G4、G6擴(kuò)配后，接入100L發(fā)酵罐發(fā)酵，每天監(jiān)測(cè)酵母菌數(shù)量，連續(xù)16d，每天取樣測(cè)定雙乙酰含量，連續(xù)14d，發(fā)酵完成后測(cè)定發(fā)酵度，測(cè)定pH、總酸、酵母凝聚性、α-氨基氮、α-氨基氮同化率。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過(guò)程酵母數(shù)跟蹤

近代啤酒生產(chǎn)酵母使用代數(shù)低（＜5代），為了縮短發(fā)酵前期酵母的增殖時(shí)間，一般選擇繁殖速度較快的菌株。供試菌株發(fā)酵過(guò)程中酵母數(shù)量消長(zhǎng)情況見圖2。由圖2可見，T2和G4大約5d時(shí)間達(dá)到最大酵母數(shù)，但是T2的酵母數(shù)只有約45×106個(gè)/mL，之后酵母數(shù)迅速下降。T1和T3的最大酵母數(shù)雖然也只有45×106個(gè)/mL，但是它們達(dá)到最大酵母數(shù)的時(shí)間要比T2遲。G6的最大酵母數(shù)也好于T1、T2和T3，在第8d達(dá)到約50×106個(gè)/mL。從圖2可以看出，G4菌株高峰期酵母數(shù)量明顯高、G6菌株次之。

圖2 供試菌株發(fā)酵過(guò)程酵母數(shù)變化曲線Fig.2 The variation curves of yeast on fermentation process

2.2 供試菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)雙乙酰跟蹤分析

雙乙酰作為啤酒的一種風(fēng)味物質(zhì)，其含量多少會(huì)影響啤酒的風(fēng)味與質(zhì)量。雙乙酰適量時(shí)將會(huì)賦予啤酒特殊風(fēng)味，但是當(dāng)啤酒中雙乙酰含量超過(guò)閾值0.1mg/L時(shí)，嚴(yán)重影響啤酒的口感，使啤酒產(chǎn)生一種餿飯味[14]?？刂破【浦械碾p乙酰含量可以通過(guò)選育少生成雙乙酰菌株和加速雙乙酰的還原兩種方式實(shí)現(xiàn)。在主發(fā)酵過(guò)程有雙乙酰合成和還原的反應(yīng)，選育在主酵期雙乙酰生成量少、還原速度快的菌株，可加速啤酒成熟、縮短后酵期。由圖3可見，G4和G6菌株的雙乙酰生成峰值明顯低于T1、T2和T3，而還原雙乙酰的速度比T1、T2和T3菌株還原速度快。在T1、T2和T3中，T2菌株的雙乙酰生成量最多而還原速度最慢。

圖3 供試菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)雙乙酰變化曲線Fig.3 The diacetyl curve of fermentation experiment of test strains

2.3 待濾酒發(fā)酵度

酵母菌種對(duì)糖利用通常用發(fā)酵度來(lái)衡量。發(fā)酵度的高低不但決定殘?zhí)呛亢途凭?，同時(shí)會(huì)影響啤酒的口感和保存期。發(fā)酵過(guò)程中只有控制好發(fā)酵度，才能更好地控制影響風(fēng)味的副產(chǎn)物。麥芽汁濃度相同時(shí)，發(fā)酵度低，啤酒爽口程度一般、有甜味；發(fā)酵度太高，啤酒口感淡薄、回味不夠。優(yōu)良菌株的真正發(fā)酵度應(yīng)達(dá)65%～70%[16]。供試菌株發(fā)酵度見圖4，G4和G6的發(fā)酵度在啤酒酵母適宜的發(fā)酵度范圍內(nèi)，其值高于T1、T2和T3，且在這些菌種中，T2的發(fā)酵度最低。

圖4 供試菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)酵度比較Fig.4 The degree fermentation of test strains

2.4 供試酵母菌株發(fā)酵待濾酒分析

啤酒酵母具有凝聚性的特征，是由酵母凝聚基因和外界條件決定，菌種不同凝絮性差異很大。凝聚性好的酵母，主發(fā)酵結(jié)束時(shí)能迅速沉降在發(fā)酵罐底部而便于分離，降低分離酵母能耗，防止酵母長(zhǎng)時(shí)間懸浮而自溶。酵母菌株凝絮性強(qiáng)可使后續(xù)工藝簡(jiǎn)化、提高酒的清亮度及口感[17]。凝聚性太強(qiáng)的酵母，酵母細(xì)胞沉淀快，發(fā)酵液中的細(xì)胞密度低，發(fā)酵慢導(dǎo)致發(fā)酵度低；酵母的凝聚性太弱，細(xì)胞沉淀慢，發(fā)酵液中的細(xì)胞密度高，發(fā)酵快，發(fā)酵度高，但酵母細(xì)胞難從酒液中分離。因此要求生產(chǎn)菌株的凝絮性適中，使發(fā)酵液既能達(dá)到較高的發(fā)酵度，菌體又易分離。表3中，T1和T2菌株凝聚性好于T3、G4和G6。五種菌株待濾酒的pH和總酸均在正常范圍。

麥汁中α-氨基氮含量過(guò)低，必然會(huì)導(dǎo)致酵母增殖少，發(fā)酵緩慢，雙乙酰含量增高，高級(jí)醇含量升高等一系列技術(shù)質(zhì)量問題。酵母增殖必須有合成細(xì)胞的含氮物質(zhì)存在。酵母對(duì)α-氨基氮同化的量隨酵母品種、接種量、麥汁中α-氨基氮的含量及發(fā)酵條件不同而有較大差異。α-氨基氮同化快，同化多，則酵母繁殖多，酵母健壯，發(fā)酵力強(qiáng)。因此通過(guò)測(cè)定α-氨基氮的同化率可以間接了解酵母的生長(zhǎng)發(fā)酵情況。表3表明，G4和G6的α-氨基氮同化率均高于T1、T2和T3，從而使發(fā)酵液中雙乙酰的生成量要少于T1、T2和T3，這個(gè)結(jié)果恰好與圖3結(jié)果相吻合。

表3 供試酵母菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)品評(píng)結(jié)果Table 3 The results of fermentation taste of test strains

3 結(jié)論

用青島啤酒酵母T1、T2、T3和高濃酵母G4、G6進(jìn)行100L發(fā)酵，高濃酵母G4和G6發(fā)酵過(guò)程中酵母數(shù)變化、雙乙酰變化、發(fā)酵度和α-氨基氮同化率指標(biāo)好于青島啤酒酵母T1、T2和T3。青島啤酒酵母T2菌株凝聚性優(yōu)于T1和T3菌株，其他指標(biāo)都不如T1和T3。因此，確定T1、T3和G4、G6為融合親株，下一步進(jìn)行原生質(zhì)體融合。

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