高效液相色譜法快速測(cè)定紫貽貝中的?；撬?/h1>

2013-12-08 06:44:48鄭平安張春丹蘇秀榕

食品工業(yè)科技訂閱 2013年4期 收藏

關(guān)鍵詞：貽貝?；撬?/a>色譜法

張 亮，劉 文，鄭平安，黃 健，李 曄，張春丹，蘇秀榕，*

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211；2.北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，北京101200）

牛磺酸（Taurine），又稱β-氨基乙磺酸，是一種非蛋白結(jié)構(gòu)的含硫氨基酸，在魚貝類尤其是軟體動(dòng)物中含量十分豐富[1]。?；撬釋?duì)人體起十分重要的生理調(diào)節(jié)功能，在促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育[2]、提高學(xué)習(xí)記憶能力[3]及延緩衰老[4]等方面具有重要調(diào)節(jié)作用，特別是對(duì)嬰幼兒的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[5-6]。據(jù)報(bào)道，貝類中馬氏珠母貝中牛磺酸含量高達(dá)13830mg/kg[7]，牡蠣中?；撬岷恐辽僖灿?000mg/kg[1]，紫貽貝中牛磺酸含量相對(duì)低一些，但也達(dá)到4400mg/kg[1]。目前以上三種貝類的市場(chǎng)價(jià)格，馬氏珠母貝和牡蠣平均價(jià)分別為60元/kg和40元/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于紫貽貝2元/kg這一低廉的價(jià)格?？梢姡腺O貝作為一種廉價(jià)的?；撬醽碓从衅鋸V泛的市場(chǎng)價(jià)值。隨著牛磺酸研究及應(yīng)用的迅速發(fā)展，?；撬岫繖z測(cè)的方法也急待建立和改進(jìn)。目前?；撬岬臏y(cè)定方法主要有分光光度計(jì)法[8]、薄層層析法[9]、氨基酸自動(dòng)分析法[10-11]和高效液相色譜法[12-13]等。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜法因其樣品預(yù)處理簡單，方法準(zhǔn)確度、精確度及靈敏度較高，在測(cè)定食品和生物組織中牛磺酸含量的應(yīng)用中日益廣泛[14-16]。其中，柱前衍生高效液相色譜法是高效液相色譜法測(cè)定牛磺酸比較常用的方法之一[1]，只需在一般的HPLC儀器上使用普通的反相柱子就可以進(jìn)行?；撬岬臏y(cè)定。其中，鄰苯二甲醛（OPA）作為柱前衍生反應(yīng)試劑在實(shí)際中應(yīng)用較多[17-19]。而國內(nèi)目前利用OPA柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定紫貽貝中?；撬釀t尚未見報(bào)道，章超樺等[20]利用氨基酸分析儀分析了翡翠貽貝游離氨基酸的組成及含量。本研究利用OPA柱前衍生—高效液相色譜法測(cè)定紫貽貝中的?；撬?，方法簡便、快速，為高效、準(zhǔn)確的?；撬岱治黾捌浞椒ń⑻峁﹨⒖?。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫貽貝（Mytilus edulisLinnaeus） 購于寧波市江北區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，開殼后取肉，勻漿、分裝，置-20℃冷凍備用；甲醇、乙腈 均為色譜純；?；撬針?biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司；硼酸、氫氧化鈉、磺基水楊酸 均為分析純；鄰苯二甲醛（OPA）、乙硫醇 均為化學(xué)純；0.4mol/L硼酸鈉緩沖液 稱取2.48g硼酸和1.41g氫氧化鈉，用水定容至100mL；衍生劑 稱取0.1g鄰苯二甲醛（OPA）用10mL甲醇溶解，加0.1mL乙硫醇，用0.4mol/L硼酸鈉緩沖液定容至100mL。

1200型高效液相色譜儀、Agilent Zorbax 300BC18（4.6mm×250mm，5μm）反相色譜柱、G1321A熒光檢測(cè)器 美國Agilent公司；CQ25-12D超聲儀 寧波江南儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 稱取紫貽貝3.0g，加10.0mL雙蒸水加熱煮沸10min，再超聲萃取15min，定容至50mL。充分混勻后，樣液于4000r/min離心10min，吸取2.0mL上述上清液于4mL離心管中，再加2.0mL 60g/L磺基水楊酸，離心10min，將此時(shí)的上清液轉(zhuǎn)移至10mL小燒杯中，滴加1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至中性，用水定容至25.0mL，待衍生用。

1.2.2 柱前衍生化反應(yīng) 吸取1.0mL上述定容液于4mL離心管中，再準(zhǔn)確加入1.0mL衍生劑搖勻，置暗處反應(yīng)2min后，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，立即進(jìn)樣20μL，進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定其峰面積，所有試樣及標(biāo)準(zhǔn)溶液從反應(yīng)至進(jìn)樣的時(shí)間應(yīng)保持一致，并控制在5min以內(nèi)。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇+乙腈+水（10∶10∶80，v/v/v）；流速0.8mL/min；進(jìn)樣量：20μL；熒光檢測(cè)器（FLD）波長：Ex330nm，Em530nm；柱溫：30℃。

1.3 定量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線：用0.02mg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/mL的?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)所得各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生反應(yīng)后進(jìn)樣20μL進(jìn)行測(cè)定。

采用外標(biāo)定量。樣品中的牛磺酸含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。

1.4 回收率測(cè)定

在同一樣品中加入一定量的?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)樣測(cè)定，以考察方法的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)不同質(zhì)量濃度?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液的出峰面積，以?；撬豳|(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（見圖1）。牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖2所示。

圖1 牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of taurine

圖2 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 The HPLCchromatogram of taurine standard solution

由圖1可知，?；撬嵩?.0～20.0μg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性回歸方程為：Y=45.954X+5.862，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。結(jié)果表明，?；撬嵩诖速|(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由圖2可知，?；撬岬谋Ａ魰r(shí)間為6.752min，出峰較快，為快速檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。

2.2 回收率測(cè)定

同一樣品分別加入不同質(zhì)量濃度的?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，各加標(biāo)量平行測(cè)定5次，利用差減法求出?；撬岬幕厥章剩ㄒ姳?）。結(jié)果表明，此方法的平均回收率為98.71%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.57%。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 Recovery test of samples

2.3 精密度測(cè)定

同一樣品重復(fù)測(cè)定6次，峰面積見表2，所測(cè)峰面積平均值為749.134±17.770，RSD為2.37%。

2.4 樣品的測(cè)定

按1.2.1和1.2.2方法處理樣品，三次平行樣測(cè)定結(jié)果及計(jì)算值見表3。由換算結(jié)果知，OPA柱前衍生高效液相色譜法測(cè)得該紫貽貝樣品中牛磺酸的平均質(zhì)量濃度為17.633μg/mL，換算到原料中?；撬岬钠骄|(zhì)量濃度為3673.631mg/kg。

表2 精密度測(cè)定結(jié)果Table 2 The result of precision test

表3 紫貽貝中牛磺酸含量Table 3 The taurine content of Mytilus edulis Linnaeus

3 討論與結(jié)論

?；撬嵋杂坞x氨基酸的形式普遍存在于水產(chǎn)品的體內(nèi)組織和浸出液以及煮汁中[21]，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于熱水中[22]。錢愛萍等[23]比較研究了6%磺基水楊酸熱水浴提取法、0.02mol/L鹽酸提取法、70%乙醇沸水浴提取法三種從海產(chǎn)品中提取牛磺酸的前處理方法，結(jié)果顯示，用6%磺基水楊酸熱水浴法提取?；撬釡y(cè)定值最高。高加龍等[24]采用偏磷酸溶液溶解馬氏珠母貝肉，并經(jīng)超聲振蕩可進(jìn)一步提取樣品中的?；撬帷１緦?shí)驗(yàn)中的樣品預(yù)處理采用熱水浴結(jié)合超聲振蕩來提取紫貽貝中的?；撬幔⑦x用60g/L磺基水楊酸作為沉淀劑來沉淀提取液中可溶性蛋白，去除蛋白的干擾。從樣品的測(cè)定結(jié)果來看，該樣品前處理方法可有效提取紫貽貝樣品中的牛磺酸，且操作簡單，實(shí)驗(yàn)中測(cè)得紫貽貝中?；撬岬暮客延形墨I(xiàn)[1]中報(bào)道紫貽貝中?；撬岬暮?400mg/kg較為接近。

使用OPA作為柱前衍生反應(yīng)試劑的優(yōu)點(diǎn)在于它與?；撬嵫苌磻?yīng)所需時(shí)間短，然而，由于其與?；撬嵘傻呐；撬嵫苌锓€(wěn)定時(shí)間較短，因此準(zhǔn)確控制衍生反應(yīng)時(shí)間是測(cè)定的關(guān)鍵?？刂品磻?yīng)至進(jìn)樣的時(shí)間和操作的一致性，可排除衍生物穩(wěn)定時(shí)間短對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

以甲醇∶乙腈∶水（10∶10∶80，v/v/v）為流動(dòng)相，在激發(fā)波長330nm，發(fā)射波長530nm條件下，平均回收率為98.71%，RSD為1.57%。OPA柱前衍生高效液相色譜法可快速測(cè)定紫貽貝中的牛磺酸，且只需要簡單的預(yù)處理就可以衍生上樣分析，并且分析時(shí)間短，線性好，靈敏度較高。

[1]譚樂義，章超樺，薛長湖，等.?；撬岬纳锘钚约捌湓诤Ｑ笊镏械姆植糩J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2000（3）：75-79.

[2]李大慶，吳明均，胡曉華，等.牛磺酸研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011（2）：390-392.

[3]宋春梅，竇肇華.?；撬崤c腦發(fā)育的研究進(jìn)展[J].第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002（1）：54-56.

[4]陳文雄，陳文珊，陳達(dá)光.?；撬崤c生長發(fā)育[J].國外醫(yī)學(xué)，婦幼保健分冊(cè)，2000（1）：3-6.

[5]蘇秀榕，李太武，丁明進(jìn).紫貽貝和厚殼貽貝營養(yǎng)成分的研究[J].中國海洋藥物，1998（2）：30-32.

[6]李學(xué)梅.?；撬岬纳碜饔肹J].中國公共衛(wèi)生，1997（7）：55-56.

[7]章超樺，吳紅棉，洪鵬志，等.馬氏珠母貝肉的營養(yǎng)成分及其游離氨基酸組成[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2000（2）：180-184.

[8]楊涓，康建宏，魏智清，等.分光光度法測(cè)定地骨皮中?；撬岷縖J].氨基酸和生物資源，2006（3）：26-29.

[9]祖如松.食品中牛磺酸的測(cè)定方法——薄層層析法[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，1998（5）：35.

[10]陳玉珍，漳廣遠(yuǎn)，龔代來，等.食品中?；撬釡y(cè)定方法的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1994（4）：406-411.

[11]王洪健，周興起，馮志強(qiáng)，等.氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定食品中?；撬岬姆椒ńJ].現(xiàn)代食品科技，2012（3）：348-350.

[12]楊素珍，王淑華，于盛茂，等.高效液相色柱前衍生化法測(cè)定食品中的?；撬醄J].食品工業(yè)科技，2002（5）：68-69.

[13]張晾，耿越，張靜靜，等.高效液相色譜法快速測(cè)定海產(chǎn)品中?；撬醄J].食品與藥品，2006（4）：56-58.

[14]Zunin P，Evangelisti F.Determination of free amino acids in infant formulas[J].International Dairy Journal，1999，9（9）：653-656.

[15]WANG X，CHI D，SU G，et al.Determination of Taurine in Biological Samples by High-Performance Liquid Chromatography Using 4-Fluoro-7-Nitrobenzofurazan as a Derivatizing Agent[J].Biomedical and Environmental Sciences，2011，24（5）：537-542.

[16]Rao R N，Maurya P K，Shinde D D，et al.Precolumn derivatization followed by liquid chromatographic separation and determination of tramiprosate in rat plasma by fluorescence detector：Application to pharmacokinetics[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，55（2）：282-287.

[17]楊祖英，張平偉.高效液相色譜法測(cè)定食品中的?；撬醄J].衛(wèi)生研究，1998（3）：49-51.

[18]錢琳琳，王京端.柱前衍生—反相高效液相色譜法測(cè)定牡蠣提取物中的?；撬醄J].中國海洋藥物，1999，18（2）：39-41.

[19]方芳，李從亮，郭鵬，等.鄰苯二甲醛柱前衍生法測(cè)定高牛磺酸的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009（7）：926-927.

[20]章超樺，洪鵬志，鄧尚貴，等.翡翠貽貝肉的食品化學(xué)特性及其在海鮮調(diào)味料的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2000（3）：267-270.

[21]黃志斌.水產(chǎn)品綜合利用工藝學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：187.

[22]龔麗芬，黃慰生，鄭志福，等.?；撬岬纳锘钚浴⑻崛∨c測(cè)定[J].福建化工，2003（1）：26-28.

[23]錢愛萍，顏孫安，余亞白，等.海產(chǎn)品中?；撬釡y(cè)定前處理方法探討[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006（5）：94-97.

[24]高加龍，章超樺，劉書成，等.鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定馬氏珠母貝中?；撬岷縖J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（1）：55-58.

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