蛋白酶激活受體-1在凝血酶誘導大鼠腦損傷及神經(jīng)再生中的作用

劉飛飛，柳夫義，王 林，胡 華

(浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，浙江杭州 310009）

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后腦損傷機制和神經(jīng)功能恢復一直是國內(nèi)外研究的熱點。自1980年Suzuki和Ebina首次提出血凝塊的毒性作用以來［1］，凝血酶在腦出血中的作用日益受到重視，現(xiàn)有研究表明，凝血酶可通過受體及非受體介導途徑導致腦損傷［2］，參與ICH后的內(nèi)源性神經(jīng)細胞再生［3-4］。

蛋白酶激活受體(protease-activated receptors，PARs)屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，現(xiàn)已知有 4種 PARs，分別為 PAR-1、PAR-2、PAR-3和 PAR-4，其中 PAR-1、PAR-3和 PAR-4由凝血酶激活，PAR-2則由胰蛋白酶激活［5］。腦內(nèi)的PAR-1主要表達在星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元［6］，PAR-3主要表達在星形膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞，PAR-4表達在星形膠質(zhì)瘤細胞［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，PAR-1激活可上調(diào)NMDA受體介導的興奮性氨基酸毒性，從而導致細胞凋亡［8］;PAR-1抑制劑 SCH79797通過ASK1/JNK信號通路減輕手術引起的神經(jīng)元損傷［9］。PAR-3可作為 PAR-1的共同受體調(diào)控PAR-1信號通路［10］，PAR-4激活可啟動p38MAPK-NFκB通路［11］。這些研究表明，PARs激活后的作用復雜，其的作用具體機制需深入研究。本研究應用大鼠海馬CA1區(qū)立體定向注射凝血酶、不同亞型蛋白酶激活受體的特異性激動劑，研究不同亞型蛋白酶激活受體的激活對腦損傷及神經(jīng)再生的影響，從而探討介導凝血酶在腦損傷和神經(jīng)再生中作用的受體亞型。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 大鼠凝血酶購自美國Sigma公司;PAR-1激動劑(活性肽TFLLRN)、PAR-3激動劑(活性肽TFRGAP-NH2)和PAR-4激動劑(活性肽 GYPGKF-NH2)均購自美國Anaspec公司;兔抗鼠GFAP抗體、兔抗鼠DCX抗體和熒光標記的山羊抗兔IgG抗體購自美國Millipore公司;山羊血清購自上海鼎國生物技術有限公司;Flouro-Jade C試劑購自美國Chemicon公司;其余化學試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 動物分組與模型制備 清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠90只，體重200～260 g，由浙江省實驗動物中心提供。采用裂區(qū)設計的方法將SD大鼠隨機分為5組:生理鹽水(NS)組、凝血酶組和3種蛋白酶激活受體激動劑組(PAR-1激動劑、PAR-3激動劑和 PAR-4激動劑)，每組18只。各組再按照時間點隨機分為1 d、3 d和7 d組。動物模型的建立依據(jù)文獻［12］，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(3 ml/kg)，固定于腦立體定位儀，75%酒精消毒皮膚后取正中切口，暴露顱骨，選取右側海馬CA1區(qū)(Bregma線后 3.5 mm，中線旁開 2.0 mm)，牙科鉆鉆開顱骨，暴露硬腦膜，用微量注射器垂直進針，深度3.0 mm。凝血酶和蛋白酶激活受體激動劑的注入劑量參照文獻［13］，以1μl/min速度分別注入 NS(10μl)、凝血酶(5 U)、PAR-1激動劑(10 nmol)、PAR-3激動劑(10 nmol)和PAR-4激動劑(10 nmol)，緩慢注射 10 min，留針5 min。術后顱骨小孔用骨蠟封閉，縫合切口，術畢放回籠中自由活動進食。分別在注射后的1 d、3 d和7 d用水合氯醛深度麻醉大鼠，4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定后取腦，腦組織置于固定液中過夜，梯度蔗糖脫水至沉底。冰凍切片機連續(xù)切片，用于免疫熒光(片厚15 μm)及 HE 染色(片厚8 μm)。

1.3 HE染色 組織切片經(jīng)95%乙醇固定30 s后，蘇木素染色1 min，1%鹽酸酒精分化10 s，伊紅復染30 s，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。光鏡觀察，應用顯微圖像分析軟件(NIH Image)計算右側海馬面積。

1.4 免疫熒光染色 切片經(jīng)PBS浸潤后加入5%山羊血清液，常溫封閉30 min后，分別加入兔抗鼠GFAP抗體(1∶150稀釋)或兔抗鼠DCX抗體(1∶150稀釋)，4℃孵育過夜。正常兔IgG用于陰性對照。切片加入熒光標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶100稀釋)，常溫避光孵育30 min，DAPI常溫避光復染15 min，50%緩沖甘油封片。熒光顯微鏡觀察，應用顯微圖像分析軟件(NIH Image)計算右側海馬CA1區(qū)GFAP熒光染色陽性細胞和DCX熒光染色陽性細胞。

1.5 Fluoro-Jade C染色 Fluro-Jade C染色方法參照文獻［14］，切片固定在防脫玻片上，室溫干燥30 min后，依次含1%NaOH的80%酒精溶液浸洗5 min，70%酒精浸洗2 min，去離子水洗2 min，0.06%高錳酸鉀溶液勻速輕搖15 min，去離子水洗1 min，含0.0001%Fluoro-Jade C染液的0.1%醋酸避光染色30 min，去離子水洗2 min×3次，吹干，二甲苯處理1 min，中性樹脂封片。熒光顯微鏡觀察，應用顯微圖像分析軟件(NIH Image)計數(shù)右側海馬CA1區(qū)的Fluoro-Jade C熒光染色陽性細胞。

2 結果

2.1 海馬面積變化 海馬注射凝血酶后1 d和3 d，海馬的面積增大，7 d后海馬的面積縮小。海馬注射PAR-1激動劑在1 d和3 d同樣引起海馬面積增大，7 d后引起海馬面積縮小。而海馬注射PAR-3激動劑和PAR-4激動劑后1 d、3 d和7 d均未引起海馬面積的明顯變化(圖1、表1)。

圖1 各組不同時間點的海馬圖像Fig.1 The representative photo of hippocampus

表1 各組海馬面積的比較Table 1 The area of hippocampus in different groups(n=6，，mm2)

表1 各組海馬面積的比較Table 1 The area of hippocampus in different groups(n=6，，mm2)

與生理鹽水組比，*P ＜0.05.

組 別1 d 3 d 7 d生理鹽水組4.875 ±0.214 4.940 ±0.325 5.147 ±0.824 PAR-1 激動劑組 5.592 ±0.354* 5.528 ±0.429* 3.615 ±0.593*PAR-3 激動劑組 5.168 ±0.595 5.175 ±0.363 5.013 ±0.380 PAR-4 激動劑組 5.137 ±0.256 5.323 ±0.820 4.907 ±0.599凝血酶組 6.055 ±0.888* 6.653 ±0.633* 3.578 ±0.533*

2.2 GFAP陽性細胞計數(shù) 海馬注射凝血酶后1 d、3 d和7 d，GFAP陽性細胞明顯增多，與注射NS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。注射3種PAR激動劑均能夠引起GFAP陽性細胞的表達增多，但與注射NS組比較僅PAR-1激動劑差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2、表2。

2.3 Fluoro-Jade C陽性細胞計數(shù) 海馬注射NS后1 d、3 d和7 d，F(xiàn)luoro-Jade C陽性細胞數(shù)極少量，而海馬注射凝血酶后1 d、3 d和7 d，F(xiàn)luoro-Jade C陽性細胞顯著增多，明顯高于NS組(P＜0.05)。PAR-1激動劑組的Fluoro-Jade C陽性細胞在1 d、3 d和7 d時均高于NS組(P＜0.05)，PAR-3激動劑組和 PAR-4激動劑組僅有少量Fluoro-Jade C陽性細胞(圖3、表3)。

圖2 各組不同時間點的GFAP免疫熒光染色Fig.2 The representative photo of GFAP fluorescence immunostaining

表2 各組海馬CA1區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)量的比較Table 2 The number of GFAP positive cells in the hippocampus CA1 region in different groups

表3 各組海馬CA1區(qū)Flouro-Jade C陽性細胞數(shù)量的比較Table 3 The number of Flouro-Jade C positive cells in the hippocampus CA1 region in different groups

2.4 DCX陽性細胞計數(shù) 注射凝血酶后3 d和7 d，海馬CA1區(qū)DCX陽性細胞增加，注射PAR-1激動劑后3 d和7 d后也有增加，與注射NS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。注射PAR-3激動劑和PAR-4激動劑后1 d、3 d和7 d，DCX陽性細胞數(shù)與注射NS組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖4、表4)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)凝血酶能夠引起海馬面積在急性期增加、慢性期萎縮，同時伴隨GFAP陽性細胞、Flouro-Jade C陽性細胞及DCX陽性細胞的增多，提示凝血酶能夠?qū)е律窠?jīng)損傷及再生。PAR-1特異性激動劑能夠模擬凝血酶的作用，而PAR-3及PAR-4特異性激動劑無類似作用，提示凝血酶的受體作用主要與PAR-1相關。

表4 各組海馬CA1區(qū)DCX陽性細胞數(shù)量的比較Table 4 The number of DCX positive cells in the hippocampus CA1 region in different groups

圖3 各組(3 d)海馬CA1區(qū)的Flouro-Jade C染色Fig.3 The representative photo of Flouro-Jade C positive cells in the hippocampus(3 d)

圖4 各組(7 d)海馬CA1區(qū)DCX染色Fig.4 The representative photo of DCX positive cells in the hippocampus(7 d)

本研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶具有直接的神經(jīng)毒性作用，表現(xiàn)為早期海馬腫脹及后期萎縮，神經(jīng)元退行性變以及星形膠質(zhì)細胞激活。凝血酶的這種毒性作用主要是通過激活PAR-1發(fā)生，PAR-3和PAR-4的作用不明顯。自Suzuki等首次提出血凝塊的神經(jīng)毒性作用［1］，大量研究發(fā)現(xiàn)凝血酶是血凝塊誘導神經(jīng)損傷的關鍵因子之一，ICH后凝血酶可通過受體途徑激活RhoA、腦內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和MAPK等通路［15］，也可通過非受體途徑激活補體表達和誘導自我吞噬現(xiàn)象發(fā)生［16］。PAR-1參與腦損傷有較多的報道，比如介導顱腦手術引起的神經(jīng)元損傷［9］、腦缺血損傷［17-18］、NMDA 引起的損傷［19］。對蛋白酶激活受體與腦損傷的研究，以PAR-1較為多見，在體外，激肽釋放酶相關肽6可通過激活PAR-1激活星形膠質(zhì)細胞［20］，PAR-1參與腦損傷后的膠質(zhì)瘢痕形成［21］，凝血酶及PAR-1還參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展［22］。

其次，在注射凝血酶和PAR-1激動劑3 d后即可出現(xiàn) DCX表達，而 PAR-3激動劑和PAR-4激動劑僅引起DCX少量表達，提示凝血酶和PAR-1激活與ICH后神經(jīng)細胞再生密切相關。在大鼠腦中風和腦外傷模型中可觀察到神經(jīng)細胞再生現(xiàn)象［23-24］，新生的神經(jīng)干細胞主要起源于腦室外側壁的腦室下帶和海馬齒狀回的顆粒細胞下層［25］，可移行至受損腦組織區(qū)域，起到改善預后的作用［26-27］。目前ICH后繼發(fā)神經(jīng)細胞再生的機制尚未闡明，有報道稱，ICH后高遷移率族蛋白1、MMPs和凝血酶均可誘發(fā)神經(jīng)細胞再生［3-4，28-29］。DCX 的表達與神經(jīng)元前體細胞的移行有關，能較準確的反映神經(jīng)細胞再生的情況，是檢測神經(jīng)細胞再生的可靠標記物［30］。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PAR-1激活是凝血酶誘發(fā)腦損傷的一個重要因素，并且PAR-1激活還參與了凝血酶所致的神經(jīng)細胞再生。相信隨著凝血酶及其受體研究的不斷深入，必將會為治療ICH后凝血酶所致腦損傷及促進神經(jīng)再生提供新的思路。

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