右美托咪定預(yù)處理減輕離體大鼠心臟缺血/再灌注損傷的線粒體相關(guān)機制

姜翠翠，夏滿莉，王 敏，陳士票

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001）

缺血性心肌梗死是當今人類的主要致死原因之一，及早恢復(fù)缺血區(qū)心肌的血流供應(yīng)是減少心肌細胞死亡，挽救患者生命的最佳辦法;但是，恢復(fù)血流灌注后又給心肌帶來了心律失常、心肌梗死等新的損傷，即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷［1］。心肌 I/R損傷機制復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)電刺激迷走神經(jīng)可減少心肌I/R引起的心肌損傷，其機制可能與抑制線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放有關(guān)［2］;研究認為，增強迷走神經(jīng)興奮可能是減少I/R損傷，挽救缺血心肌的有效輔助治療手段。

右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)為高選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑，可抑制交感神經(jīng)興奮性，增強迷走神經(jīng)興奮性，常用于血管疾病患者圍手術(shù)期的輔助麻醉與鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛，有助于減少圍手術(shù)期的心臟副反應(yīng)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，通過Dex預(yù)處理，可激活α2-腎上腺素能受體，減輕大鼠心肌I/R損傷［4-5］。再者，線粒體是缺血藥物預(yù)處理發(fā)揮心肌保護作用的終末效應(yīng)器之一［2，6］，Dex 減少心肌 I/R 損傷亦可能與調(diào)控心肌mPTP開放及其上游線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrialATP-sensitive potassium channel，mitoKATP)活性有關(guān)［2，4］，但有關(guān)Dex的心肌線粒體作用國內(nèi)外尚未見報道。本實驗應(yīng)用Langendorff模型研究Dex對離體大鼠心臟I/R時心功能及心肌梗死的影響，探討Dex預(yù)處理與心肌mitoKATP-mPTP的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 蒼術(shù)苷(atractyloside，Atr)、5-羥基癸酸(5-hydroxydecanoate，5-HD)及氯化三苯四氮唑(2，3，5-triphenylterazolium chloride，TTC)均購自 Sigma公司。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號為20100412，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測試盒購自南京建成生物工程研究所，其余試劑為市售分析純。Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L):NaCl 118.0、KCl 4.7、KH2PO41.2、MgSO41.2、NaHCO325.0、葡萄糖 10.0、CaCl22.5，pH 7.4，以95%O2+5%CO2飽和。

1.2 離體心臟Langendorff灌流和左心室功能評價 雄性SD大鼠(體重240～270 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)斷頭后開胸迅速取出心臟，置于4℃改良K-H液中洗凈血液，轉(zhuǎn)移并固定于Langendorff灌流裝置，以改良K-H液行常規(guī)恒壓(76 mmHg)灌流，維持灌流液溫度(37℃)。切開左心耳，將充水乳膠囊由此插入至左心室，囊內(nèi)壓力經(jīng)特氟綸管傳遞至壓力傳感器，由Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)記錄和分析。向插入左心室內(nèi)的乳膠囊注水使左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)維持于5～8 mmHg，連續(xù)記錄實驗過程中左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)及心率(heart rate，HR)等各項指標［7］。

1.3 心肌I/R損傷模型制備 采用全心停灌的方法制備I/R損傷模型，即心臟在Langendorff灌流裝置平衡20 min，繼續(xù)灌流20 min后，停止灌流30 min作為缺血，再灌注120 min。

1.4 冠脈流出液LDH活性的測定 在復(fù)灌5 min末收集冠脈流出液，按試劑盒說明檢測LDH活性。

1.5 心肌組織活性的測定 心臟從灌流裝置上取下后切成1～2 mm薄片，在37℃水浴中用TTC(1%)孵育30 min后，取出心肌片，吸干表面的水分并稱其濕重，加入二甲基亞砜(20 ml/g)后勻漿，離心(1000×g，10 min)，取上清液在490 nm處測量其吸光度，以吸光度值大小反映心肌組織活性。

1.6 實驗分組 大鼠隨機分為5組(n=9):①正常對照組(Con):離體心臟Langendorff灌流190 min;②I/R損傷組(I/R):離體心臟平衡20 min，繼續(xù)灌流20 min，全心停灌30 min作為缺血，然后再灌注120 min;③Dex預(yù)處理組(Dex):同I/R組，但在停灌前15 min用含Dex(10 nmol/L)的K-H液灌流，停灌30 min后用KH 液再灌注 120 min［4］;④Dex+5-HD 組:平衡20 min后用含5-HD(100 μmol/L)的K-H液灌流20 min，再灌注前15 min加入Dex(10 nmol/L)，停灌30 min后用K-H液再灌注120 min;⑤Dex+Atr組:同Dex預(yù)處理組，但于再灌注前20 min用含Atr(20 μmol/L)的K-H液灌流。

2 結(jié)果

2.1 Dex預(yù)處理對I/R心臟冠脈流量及左心室收縮功能的影響 表1示，各組別大鼠的基礎(chǔ)冠脈流量、LVDP及LVEDP差異無顯著性;與正常對照組比較，I/R組再灌注期的冠脈流量和LVDP均明顯下降(P＜0.01)，而LVEDP顯著增加(P＜0.01);Dex(10 nmol/L)預(yù)處理15 min均明顯減弱I/R對冠脈流量及LVDP的抑制作用(P＜0.01)以及對LVEDP的抬升作用(P＜0.01)，Dex預(yù)處理對再灌注期間心功能的改善作用均被5-HD及Atr所逆轉(zhuǎn)(P＜0.01)。在整個實驗過程中，各組間心率無明顯變化(數(shù)據(jù)略)。

表1 Dex預(yù)處理對I/R心臟冠脈流量及左心室收縮舒張功能的影響Table 1 Effect of dexmedetomidine(Dex)preconditioning on coronary flow and left ventricular systolic and diastolic function in isolated rat hearts subjected to ischemia/reperfusion(n=9，)

表1 Dex預(yù)處理對I/R心臟冠脈流量及左心室收縮舒張功能的影響Table 1 Effect of dexmedetomidine(Dex)preconditioning on coronary flow and left ventricular systolic and diastolic function in isolated rat hearts subjected to ischemia/reperfusion(n=9，)

與正常對照組(Con)比，＊＊P ＜0.01;與缺血/再灌注損傷組(I/R)比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與 Dex預(yù)處理組(Dex)比，+P ＜0.05，++P ＜0.01.

2.2 Dex預(yù)處理對I/R心臟心肌活性及冠脈流出液LDH含量的影響 圖1示，與正常對照組比較，I/R組再灌注結(jié)束后心肌組織活性標記物 formazan含量明顯下降(P＜0.01)，Dex(10 nmol/L)預(yù)處理15 min明顯減弱了I/R對心肌組織活性的損傷作用(P＜0.01)，該改善作用被5-HD及Atr所逆轉(zhuǎn)(P＜0.01)。由圖2所見，Dex預(yù)處理明顯抑制了I/R導(dǎo)致的冠脈流出液LDH含量增加(P＜0.01)，而5-HD及Atr處理則取消了Dex減少冠脈流出液LDH含量的作用。

圖1 Dex預(yù)處理對I/R心臟formazan含量的影響Fig.1 Effect of dexmedetomidine，5-hydroxydecanoate and atractyloside on the formazan content from the isolated rat hearts subjected to I/R

3 討論

本實驗在離體大鼠全心I/R模型上發(fā)現(xiàn)，Dex預(yù)處理明顯增加了I/R大鼠心臟冠脈流量，減少了心肌損傷標志酶LDH的漏出及心肌組織活性的下降，改善了再灌注左心室收縮與舒張功能，這些心功能改善作用均被mitoKATP阻斷劑5-HD及mPTP開放劑Atr所逆轉(zhuǎn)，提示Dex預(yù)處理具有對抗心肌I/R損傷作用，且該作用與mitoKATP的激活及下游mPTP開放受阻有關(guān)。

圖2 Dex預(yù)處理對I/R心臟冠脈流出液LDH的影響Fig.2 Effect of dexmedetomidine on the LDH activity in the coronary effluent from the isolated rat hearts subjected to I/R

在心血管系統(tǒng)中，Dex作為高選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如通過不同亞型的α2-腎上腺素能受體產(chǎn)生舒張或收縮血管效應(yīng)［8］，增強迷走神經(jīng)興奮性使心肌耗氧降低，防止缺血心肌因能量耗竭而梗死［3，5］。由于 Dex 具有良好的心血管保護作用，其越來越多地應(yīng)用于圍手術(shù)期的輔助麻醉［9］，但是有關(guān)Dex對I/R心肌損傷作用的研究卻不多見，且基本上停留在α2-腎上腺素能受體激動劑的研究水平，其下游所涉及的機制并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，Dex的心肌保護作用在臨床鎮(zhèn)靜用藥時達到的最小與最大血漿濃度(0.23 ～2.3 ng/ml，對應(yīng)1 ～10 nmol/L)范圍內(nèi)是濃度依賴性增強的［4］，故本實驗選擇近似于臨床Dex用藥濃度的上限值，以期產(chǎn)生探討Dex心肌保護作用的線粒體相關(guān)機制。

心肌I/R損傷涉及的機制復(fù)雜，其中再灌注期的活性氧自由基大爆發(fā)、心肌細胞內(nèi)Ca2+超載等因素促使mPTP開放，線粒體膜電位崩解，釋放細胞色素C等諸多凋亡誘導(dǎo)因子至細胞質(zhì)誘發(fā)細胞凋亡，這是公認的心肌I/R損傷的經(jīng)典途徑［7］。本研究是在離體心臟上進行的，排除了迷走神經(jīng)興奮在Dex預(yù)處理心肌保護作用中的影響，Dex改善了再灌注離體心臟的冠脈流量及左心室泵血功能，這可能是因為Dex通過激活冠狀動脈的α2-腎上腺素能受體，促使血管短暫收縮，產(chǎn)生了類似于缺血預(yù)處理的作用［4］;且Dex亦有可能通過激活心肌細胞的α-腎上腺素能受體，產(chǎn)生正性肌力作用，提高I/R心臟左心室泵血功能，由此冠脈循環(huán)增加，增加心肌氧及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，形成心功能改善的良性循環(huán)。Dex的心功能改善作用被mPTP開放劑Atr所取消，提示Dex預(yù)處理可能抑制了心肌mPTP在再灌注期間的開放，維持了線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整性，減少了線粒體依賴性細胞凋亡［2，8］。Dex預(yù)處理組心肌組織活性增加及冠脈流出液LDH含量減少，進一步說明Dex預(yù)處理明顯減少了I/R誘導(dǎo)的心肌細胞膜破裂及線粒體功能紊亂。

缺血前mitoKATP開放是抵抗心肌I/R損傷的一條重要通路，mitoKATP開放后可能通過激活再灌注期蛋白激酶C-ε、磷脂酰肌醇-3-激酶或腺苷A2b受體，共同促進線粒體糖原合成酶激酶-3β磷酸化，并抑制線粒體基質(zhì)親環(huán)蛋白D與內(nèi)膜腺嘌呤核苷酸移位酶的結(jié)合(這兩者是構(gòu)成mPTP的主要成分)，由此減少線粒體依賴的心肌細胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用［10］。本實驗中Dex預(yù)處理所產(chǎn)生的心肌保護作用被mitoKATP阻斷劑5-HD所取消，提示Dex預(yù)處理可能在心肌缺血前激活了mitoKATP，啟動了再灌注期心肌保護的線粒體通路。有研究顯示mitoKATP開放后，減少了心肌線粒體Ca2+超載以及由此帶來的氧化應(yīng)激，從而抑制mPTP開放并維持線粒體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［7］。缺血前5-HD處理及再灌注早期添加Atr均取消了Dex預(yù)處理的心肌保護作用，進一步提示缺血前mitoKATP激活以及由此引發(fā)的再灌注期mPTP開放受阻，這可能是Dex預(yù)處理發(fā)揮心肌保護作用的一條重要的線粒體通路。

綜上所述，盡管缺血預(yù)處理的心肌保護作用是公認的，但是由于其操作上的難度在臨床應(yīng)用上并不可行。本研究發(fā)現(xiàn)Dex作為一種圍手術(shù)期常用的輔助麻醉與鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥，具有減少心肌I/R損傷作用，且該心肌保護作用可能與Dex促進心肌缺血前mitoKATP的開放，抑制再灌注早期mPTP的開放有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為心血管手術(shù)中預(yù)處理心肌保護藥物的選擇提供了新思路，Dex在作為麻醉藥的同時，亦可能是一種有效且易于實施的抗心肌I/R損傷的預(yù)處理藥物。

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