HIFU聯(lián)合微泡消融兔肝VX2腫瘤:殘瘤檢測(cè)的病理及影像對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究

何 煒，王 維，彭 松

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院1.超聲科;2.放射科，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

高強(qiáng)度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound，HIFU)是超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近十余年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)治療新技術(shù)，其利用體外分散發(fā)射的超聲波，通過(guò)水、介質(zhì)、皮膚在體內(nèi)腫瘤部位聚焦，在焦點(diǎn)區(qū)域形成瞬間局部高溫和空化損傷，將腫瘤細(xì)胞消融，而在焦點(diǎn)區(qū)域之外的部位則溫度升高很低，因此對(duì)周圍組織無(wú)損傷［1-2］。然而，HIFU的臨床療效因受到一些影響因素的干擾而減低，如肋骨及胃腸氣體遮擋、輻照時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、腫瘤血供豐富等，均可能降低靶區(qū)HIFU能量或者增加輻照通道組織的能量沉積，從而導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，如皮膚燒傷、胃腸道穿孔及殘瘤等［3-4］。

聯(lián)用超聲微泡造影劑增強(qiáng)HIFU消融腫瘤效果是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一［2，5-6］，準(zhǔn)確評(píng)估消融范圍及識(shí)別殘瘤對(duì)臨床有重要指導(dǎo)意義。造影劑增強(qiáng)螺旋CT(CECT)是臨床認(rèn)可的熱消融術(shù)后檢測(cè)殘瘤的金標(biāo)準(zhǔn)［1］，許多研究表明，超聲造影(CEUS)可以敏感、準(zhǔn)確和實(shí)時(shí)地檢測(cè)腫瘤滋養(yǎng)血管［6-7］。但目前尚未見HIFU聯(lián)合微泡消融兔肝VX2腫瘤后CEUS同CECT檢測(cè)殘瘤能力的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究。為此，本研究擬探討單純HIFU同HIFU聯(lián)合微泡消融兔肝VX2腫瘤的殘瘤發(fā)生率以及評(píng)估CEUS和CECT檢測(cè)殘瘤的能力。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 FEP-BY02型高能聚焦超聲腫瘤治療機(jī)(北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司生產(chǎn));ALOKA Prosound α10 和 ACUSON Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀，淺表探頭，頻率 7～10 MHz，配備造影成像軟件;Philips Brilliance 64排螺旋CT，MEDRAD雙筒高壓注射器等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康新西蘭大白兔40只(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部提供)，雌雄不限，體質(zhì)量2.5 ～3.0 kg;股內(nèi)側(cè)皮下 VX2 種植瘤種兔1只(武漢大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院放射科惠贈(zèng))。

1.3 兔肝VX2腫瘤模型建立 以3%戊巴比妥鈉按1.0 ml/kg體重經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉。以8%硫化鈉脫去腹部肝區(qū)體毛，外用生理鹽水洗凈，劍突下正中切口，暴露肝左中葉。以眼科鑷在肝表面刺1個(gè)深約1 cm的隧道，壓迫止血備用。從VX2荷瘤種兔體內(nèi)取出有活力的腫瘤組織，無(wú)菌生理鹽水漂洗，修剪成約2 mm3的組織塊。將1～2個(gè)修剪好的組織塊植入隧道內(nèi)，肝包膜破口用修剪好的小薄片明膠海綿封堵。然后，順序縫合腹膜、肌層和皮膚。腫瘤植入后，飼養(yǎng)兔14 d即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 40只荷瘤兔隨機(jī)分為假照組(n=10)、單純HIFU組(n=15)和HIFU聯(lián)合微泡組(n=15)。

1.5 影像學(xué)檢測(cè) HIFU消融前后3 h內(nèi)完成CEUS和CECT檢查。每次檢查前動(dòng)物禁食12 h，不禁水。首先使用24G靜脈留置針置入家兔耳緣靜脈內(nèi)建立血管通路，膠布固定后備用。將荷瘤兔全麻并固定在檢查臺(tái)上，系腹帶控制腹部呼吸運(yùn)動(dòng)幅度。

1.5.1 CEUS檢查 造影前二維超聲多方位掃查兔肝腫瘤，測(cè)量最大徑(cm)。采用Bracco公司超聲造影劑SonoVue，按說(shuō)明書配制，每次使用劑量為0.2 ml/kg，經(jīng)家兔耳緣靜脈團(tuán)注，繼而注射2 ml生理鹽水沖管。所有調(diào)節(jié)參數(shù)(深度、聚焦、總增益、TGC等)保持不變，設(shè)定機(jī)械指數(shù)＜0.11，使用1 ml注射器行團(tuán)注同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器。小幅度側(cè)動(dòng)探頭觀察全瘤增強(qiáng)特征。所有影像均存儲(chǔ)于主機(jī)硬盤內(nèi)。待CEUS完畢后立即行MDCT。

1.5.2 CECT 檢查 Philips Brilliance 64 排螺旋CT掃描，探測(cè)器組合:0.625 mm×64;高壓注射器:MEDRAD雙筒高壓注射器;圖像后處理工作站:Mxview 2.1工作站;對(duì)比劑:非離子型對(duì)比劑碘海醇(350 mg/ml)。Pitch值為1.172，F(xiàn)OV 為 96 mm，Matrix 為 512，Rotation time 為 0.4 s，層厚 2.5 mm，非螺旋掃描，120 kV，80 mA，360 度旋轉(zhuǎn)時(shí)間 1.2 s，每轉(zhuǎn)掃描時(shí)間0.75 s，掃描50次，掃描總時(shí)間60 s。將對(duì)比劑自靜脈套管從雙筒高壓注射器A管以1.5 ml/s速率注入，劑量為2 ml/kg，注射完畢后B管以同速率注入10 ml生理鹽水。先行常規(guī)全肝平掃，確定病灶及感興趣區(qū)的范圍及層面，于造影劑注射后延遲1 s開始掃描。圖像存儲(chǔ)于主機(jī)硬盤。

1.6 HIFU消融 治療參數(shù):輸出電功率200～600 W，單元發(fā)射時(shí)間(t1)為 0.15 s，占空時(shí)間(t2)為0.2 ～0.4 s，單點(diǎn)次數(shù)(T)為 30 ～50次。各參數(shù)可根據(jù)所治療腫瘤的位置及層次深淺、腫瘤組織密度及超聲衰減率適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整，在實(shí)際治療中的治療點(diǎn)劃分和焦點(diǎn)的位移均由計(jì)算機(jī)控制完成。實(shí)時(shí)超聲顯示輻照點(diǎn)變?yōu)閺?qiáng)回聲并且持續(xù)至少2 min為發(fā)生局部凝固性壞死的標(biāo)志，可以轉(zhuǎn)為下一點(diǎn)的消融［6］。

假照組:關(guān)閉治療功率源，假照30 s后中止治療。單純HIFU組:經(jīng)機(jī)載超聲監(jiān)控系統(tǒng)準(zhǔn)確定位腫瘤后，開始輻照。HIFU聯(lián)合微泡組:經(jīng)耳緣靜脈快速團(tuán)注0.2 ml SonoVue微泡，15 s后開始輻照。記錄單純HIFU組和HIFU聯(lián)合微泡組的劑量參數(shù):輻照點(diǎn)數(shù)(n)、輻照時(shí)間(t=n×t1)及電功率。

1.7 組織病理學(xué)檢查 第2次影像學(xué)檢查完畢之后，即刻注射過(guò)量麻藥處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，剖腹觀察有無(wú)照射通道損傷、胃腸穿孔、肝破裂等并發(fā)癥，取出肝臟，將腫瘤組織及瘤周5 mm肝組織取材切割為4～5塊，浸泡于10%福爾馬林溶液24 h后石蠟包埋，多方位多點(diǎn)切片，行光鏡及電鏡檢查判斷組織消融情況及有無(wú)殘瘤。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間CEUS和CECT的不同增強(qiáng)模式構(gòu)成比較采用χ2檢驗(yàn)，各組間劑量參數(shù)比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，消融后CEUS和CECT對(duì)殘瘤的檢測(cè)及其同病理的一致率采用χ2檢驗(yàn)確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 消融前CEUS和CECT觀察各組腫瘤的血供情況 40灶兔肝VX2腫瘤在消融前CEUS和CECT分別表現(xiàn)為2種動(dòng)脈相增強(qiáng)模式(表1)。CEUS對(duì)整體增強(qiáng)模式的顯示率明顯高于 CECT(77.5%vs 52.5%)，而 CECT 對(duì)厚環(huán)狀增強(qiáng)模式的顯示率明顯高于CEUS(47.5%vs 22.5%)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.263，P=0.001)。

表1 40灶兔肝 VX2腫瘤消融前 CEUS和CECT增強(qiáng)模式比較Table 1 Comparison of enhancement patterns of CEUS and CECT in 40 rabbit VX2 tumors (例)

假照組、單純HIFU組和HIFU聯(lián)合微泡組腫瘤大小分別為(1.48 ±0.20)cm、(1.47 ±0.25)cm 和(1.47 ±0.16)cm，各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.016，P=0.985)。假照組中CEUS顯像6例呈彌漫性增強(qiáng)，4例呈厚環(huán)狀增強(qiáng);而CECT顯像5例呈彌漫性增強(qiáng)，5例呈厚環(huán)狀增強(qiáng)。單純HIFU組中CEUS顯像13例呈彌漫性增強(qiáng)，2例呈厚環(huán)狀增強(qiáng);而CECT顯像7例呈彌漫性增強(qiáng)，8例呈厚環(huán)狀增強(qiáng)。HIFU聯(lián)合微泡組中CEUS顯像12例呈彌漫性增強(qiáng)，3例呈厚環(huán)狀增強(qiáng);而CECT顯像9例呈彌漫性增強(qiáng)，6例呈厚環(huán)狀增強(qiáng)。各組間CEUS和CECT的不同增強(qiáng)模式構(gòu)成比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.533，P=0.307 和 χ2=0.568，P=0.788)。所有腫瘤均為動(dòng)脈相富血供，門脈相造影劑迅速廓清，呈“快進(jìn)快出”。

2.2 HIFU聯(lián)合微泡消融兔肝VX2腫瘤的劑量參數(shù) HIFU聯(lián)合微泡組的平均輻照時(shí)間、輻照點(diǎn)數(shù)及電功率均較單純HIFU組為低(P＜0.01，表 2)。

表2 單純HIFU組和HIFU聯(lián)合微泡組劑量參數(shù)比較Table 2 Comparison of HIFU dose parameters between HIFU group and HIFU+microbubble group

2.3 消融后CEUS和CECT對(duì)殘瘤的檢測(cè)及其同病理的一致率 本研究三組均順利完成HIFU輻照，其中假照組影像學(xué)無(wú)明顯變化，病理組織學(xué)顯示腫瘤內(nèi)豐富的微血管形成，僅有2例腫瘤中心有小片液化性壞死存在;單純HIFU組主要表現(xiàn)為凝固性壞死，組織結(jié)構(gòu)輪廓存在;而HIFU聯(lián)合微泡組腫瘤細(xì)胞漿及組織間隙內(nèi)出現(xiàn)了大量的空化泡，組織結(jié)構(gòu)崩解消失。單純HIFU組殘瘤率為60.0%(9/15)，HIFU聯(lián)合微泡組為13.3%(2/15)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表3)。

表3 單純HIFU組和HIFU聯(lián)合微泡組輻照后并發(fā)癥比較Table 3 Comparison of complications between HIFU group and HIFU+microbubble group (例)

CEUS和CECT對(duì)完全消融者表現(xiàn)為腫瘤區(qū)域無(wú)造影劑進(jìn)入，呈“黑洞征”;對(duì)有殘瘤者，CECT表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)局灶異常增強(qiáng)信號(hào)，CEUS表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)局部殘存微血管顯像，呈“枯枝樣”(圖1和2)。CEUS和CECT檢測(cè)殘瘤同病理診斷的一致率分別為81.8%和27.3%，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表4)。

表4 CEUS和CECT檢測(cè)殘瘤同病理一致率的比較Table 4 Comparison of concordance rate of residual tumor between CEUS and CECT with pathology

圖1 單純HIFU組消融后CEUS、CECT與組織病理變化Fig.1 CEUS，CECT and pathohistologic apperance in HIFU group

圖2 HIFU聯(lián)合微泡組消融后CEUS、CECT與病理組織變化Fig.2 CEUS，CECT and pathohistologic apperance in HIFU+microbubble group

3 討論

HIFU是近年來(lái)發(fā)展迅速的一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)性腫瘤消融術(shù)，主要利用熱效應(yīng)和空化效應(yīng)等對(duì)組織產(chǎn)生的凝固性壞死和空化機(jī)械損傷等原理，研究表明其與肝切除術(shù)療效相當(dāng)［2，8］。目前HIFU的臨床療效因受到一些影響因素的干擾而減低，如肋骨及胃腸氣體遮擋、輻照時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、腫瘤血供豐富等，均可能降低靶區(qū)HIFU能量或者增加輻照通道組織的能量沉積，從而會(huì)導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，如皮膚燒傷、胃腸道穿孔及導(dǎo)致殘瘤等［3-4］。造成腫瘤凝固性壞死體積的大小取決于兩方面因素:①HIFU治療劑量;②活體生物組織的生物學(xué)特性［8］。提高HIFU治療劑量雖然可以增加靶區(qū)的凝固性壞死體積，全面徹底的消融病灶，但是不可避免的會(huì)產(chǎn)生一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，如皮膚燒傷、胃腸道穿孔及腹膜粘連等［3-4］。通過(guò)改變活體組織的生物學(xué)特性以提高HIFU作用效率是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，而經(jīng)周圍靜脈注射可使超聲造影劑微泡迅速到達(dá)血供豐富的腫瘤內(nèi)部及其周圍組織，引入外源性空化核，使其組織聲環(huán)境得以改變，具有良好的增效性［2，5-6］。

兔肝VX2腫瘤血供豐富且主要由肝動(dòng)脈滋養(yǎng)［9］，同人類肝細(xì)胞癌具有相似的血供特征，因此成為肝癌基礎(chǔ)研究中最重要、最常用的動(dòng)物模型之一［10］。本研究40灶兔肝VX2腫瘤模型均為移植后14 d，屬于早期階段，CECT和CEUS均顯示其為動(dòng)脈期富血供，之后快速消退，假照組的病理結(jié)果也顯示腫瘤內(nèi)豐富的滋養(yǎng)微血管形成，同影像結(jié)果一致。而CEUS和CECT對(duì)兩種增強(qiáng)模式:整體增強(qiáng)和厚環(huán)狀增強(qiáng)的顯示率不同，本研究認(rèn)為，CEUS所反映的兔肝VX2腫瘤血供狀態(tài)較CECT更加真實(shí)，分析原因可能與這兩種影像手段成像原理不同有關(guān)。CECT只是以固定的時(shí)間間隔進(jìn)行的非連續(xù)性掃描，可能錯(cuò)過(guò)增強(qiáng)過(guò)程中一些稍縱即逝的動(dòng)態(tài)變化特征;而CEUS為實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯像，可實(shí)時(shí)觀察并追蹤腫瘤的滋養(yǎng)血管，動(dòng)態(tài)顯示造影劑進(jìn)入腫瘤及周圍肝實(shí)質(zhì)直至消退的完整過(guò)程，可更好的顯示腫瘤新生動(dòng)脈血管的血流灌注特點(diǎn)［6，7，11］。由于團(tuán)注造影劑后在肝動(dòng)脈首過(guò)供血時(shí)間短暫，加之早期兔肝VX2瘤惡性程度高，滋養(yǎng)微血管大量形成且發(fā)育不成熟［12］，使得造影劑可以通過(guò)動(dòng)靜脈或門靜脈-肝靜脈“短路”途徑快速廓清，因此動(dòng)脈相持續(xù)時(shí)間亦短暫，CECT可能錯(cuò)過(guò)短暫的最佳成像的時(shí)間，而對(duì)其之前的不完全增強(qiáng)或者之后的消退開始成像，即多表現(xiàn)為厚環(huán)狀增強(qiáng)。而CEUS能夠完整的捕捉腫瘤整體增強(qiáng)的瞬間，對(duì)于本研究早期實(shí)性富血供的兔肝VX2腫瘤而言，即多表現(xiàn)為整體彌漫性增強(qiáng)。

本研究結(jié)果顯示，HIFU聯(lián)合新型的超聲造影劑微泡SonoVue對(duì)兔肝VX2腫瘤的治療安全、有效、可行。為達(dá)到即刻的HIFU治療效果［6］，HIFU聯(lián)合微泡組的劑量參數(shù)均明顯低于單純 HIFU組，并且無(wú)明顯并發(fā)癥，提示SonoVue微泡有顯著增強(qiáng)HIFU的作用效應(yīng)。本研究還顯示，單純HIFU組的殘瘤率較HIFU聯(lián)合微泡組明顯高(P＜0.01)，分析原因:兔肝VX2腫瘤中央部位的血管多為管徑較細(xì)小的滋養(yǎng)血管，因此單純HIFU組的主要作用機(jī)制熱效應(yīng)可以對(duì)其有效破壞，而腫瘤邊緣部位血管多為自周邊肝臟組織伸入的較大管徑的滋養(yǎng)血管，其內(nèi)血流速度較快，會(huì)很快將局部熱量帶走，熱效應(yīng)對(duì)其難以產(chǎn)生效果，而HIFU聯(lián)合微泡組對(duì)較大管徑的滋養(yǎng)血管及毛細(xì)血管均可有效破壞，也提示了機(jī)械空化效應(yīng)可能為主要作用原理。病理組織學(xué)顯示，HIFU聯(lián)合微泡組腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)了大量的空化泡，組織結(jié)構(gòu)崩解破壞，提示其增效機(jī)制可能與外源性微泡導(dǎo)致空化及機(jī)械損傷增強(qiáng)有關(guān)。本研究從組織病理學(xué)角度也充分證實(shí)，HIFU聯(lián)合微泡組的殘瘤形成明顯少于單純HIFU組，且無(wú)明顯并發(fā)癥，提示HIFU聯(lián)合微泡可以顯著提高兔肝VX2腫瘤的消融效果。兩組均有不同程度殘瘤的發(fā)生可能還與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療時(shí)呼吸幅度控制不好有關(guān)，造成了焦點(diǎn)的偏離。提示無(wú)論用何種手段進(jìn)行治療，單次HIFU輻照尚不能造成組織的完全消融，需要多次治療才能取得更好的療效。

本研究結(jié)果顯示，CEUS對(duì)殘瘤的檢出率高于CECT，同病理組織學(xué)的一致率明顯高于CECT。分析原因，可能與CEUS使用14 MHz的高頻探頭，而兔肝VX2腫瘤距離體表表淺且直徑較小(＜2 cm)有關(guān)，這樣可以進(jìn)行實(shí)時(shí)高分辨率造影成像，可以清晰的追蹤微泡在腫瘤微血管內(nèi)的流動(dòng)狀態(tài)。CEUS使用低機(jī)械指數(shù)發(fā)射聲束，SonoVue微泡在聲束作用下發(fā)生連續(xù)共振而不會(huì)破裂，接收返回的二次諧波信號(hào)即可編碼高分辨成像。微泡可在微循環(huán)中持續(xù)存在長(zhǎng)達(dá)數(shù)分鐘，使CEUS具備充裕的時(shí)間觀察。注射后首次到達(dá)兔肝VX2腫瘤滋養(yǎng)血管是濃度最高的實(shí)相，成像最佳，之后雖然有所消退但仍可清晰顯像。因此，在動(dòng)脈相如果CEUS于一個(gè)切面上發(fā)現(xiàn)有殘瘤微血管斷面，之后的時(shí)相內(nèi)小幅度側(cè)動(dòng)探頭就可對(duì)其在腫瘤內(nèi)的走行及增強(qiáng)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)追蹤顯像，完整的評(píng)估殘瘤范圍。

CECT對(duì)HIFU治療后殘瘤的檢出率較低，而且同病理診斷的一致率較差，本研究認(rèn)為原因如下:①相對(duì)于較小的兔肝VX2腫瘤(＜2 cm)，CECT成像分辨率欠佳;②造影劑循環(huán)存在個(gè)體差異，很難判斷何時(shí)腫瘤內(nèi)造影劑達(dá)峰值，而固定間隔的非連續(xù)掃描往往會(huì)錯(cuò)過(guò)殘瘤增強(qiáng)的最佳時(shí)間;③殘瘤內(nèi)血管細(xì)小、分支較少時(shí)，CECT分辨困難。還有研究表明，熱消融術(shù)后早期觀察即刻療效，CECT出現(xiàn)周圍邊緣增強(qiáng)偽像的發(fā)生率要明顯高于CEUS，這會(huì)大大干擾對(duì)即刻療效的評(píng)估，進(jìn)而會(huì)影響是否二次消融的決斷［13］。此外，本研究認(rèn)為 CEUS較CECT操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)少，可以在消融術(shù)后HIFU治療臺(tái)旁進(jìn)行，可以準(zhǔn)確的指導(dǎo)評(píng)估消融效果及是否需要即刻對(duì)殘瘤部位補(bǔ)充消融，這些優(yōu)點(diǎn)是CECT暫時(shí)所無(wú)法取代的。

綜上，HIFU聯(lián)合超聲造影劑微泡SonoVue可以顯著提高兔肝VX2腫瘤的消融效果，CEUS檢測(cè)殘瘤的能力優(yōu)于CECT，對(duì)于應(yīng)用于臨床的價(jià)值還有待于進(jìn)一步的研究。

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