大吳風草總黃酮含量季節(jié)動態(tài)變化及對逆境脅迫的響應

崔大練，馬玉心

(浙江海洋學院海洋科學學院，浙江舟山 316000）

大吳風草(Farfujium japonicum Lindl.)又名蓮蓬草，屬菊科大吳風草屬植物，多年生草本，分布區(qū)域從中國東南部經(jīng)琉球群島和臺灣一直到日本［1］。大吳風草是重要的藥用植物資源，其干燥的根狀莖、葉片、葉柄均可入藥，具有清熱、解毒、活血的功能［2］;也是重要的園林綠化植物，宜植于大樹下、高大建筑物背陰處、林地，也可布置蔭蔽處的花壇、花境，常用做路旁的花境做背景或點綴，十分美麗［3］。其生境范圍相當廣泛，常生于低海拔的林下、山地、山谷、海濱草叢;其野生環(huán)境多為林下，郁閉度在80%以上，能成片生長，而且長勢較好，土壤基質(zhì)多為土質(zhì)疏松、排水良好、富含有機質(zhì)的土壤。隨著野生資源不斷被挖掘利用，人們開始人工栽培大吳風草，由于其適應性較強，即使在向陽處、土質(zhì)瘠薄甚至鹽堿地均能生長，所以繁殖比較容易。大吳風草的化學成分主要為揮發(fā)油、萜類(倍半萜、二萜、三萜)、酚類、生物堿類、甾體類以及脂肪酸類等［4］;目前，國內(nèi)外對大吳風草的研究主要集中在生理生態(tài)、分類鑒定等方面，對大吳風草器官中黃酮類物質(zhì)含量隨季節(jié)性變化的動態(tài)研究及脅迫因子對總黃酮含量的影響，迄今國內(nèi)外尚未見報道。為此，本研究采用乙醇超聲提取-分光光度法對大吳風草不同器官在不同脅迫條件下的黃酮含量及其動態(tài)變化進行研究，為大吳風草的種植、資源保護及其黃酮類化合物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蘆丁標準曲線的制作 根據(jù)張志良(2003)《植物生理學實驗指導》的實驗方法制作蘆丁標準曲線［5］。

1.2 大吳風草總黃酮含量季節(jié)動態(tài)測定 大吳風草分別于 2011 年 4、6、8、10、12 月初采集于舟山市定海區(qū)長崗山森林公園，經(jīng)溫州大學生命與環(huán)境科學學院丁炳揚專家鑒定為菊科大吳風草屬植物大吳風草(Farfujium japonicum Lindl.)的全草。實驗時選擇植株大小一致、生長年齡相同的大吳風草植株作為試驗對象，并將其葉、葉柄、根狀莖低溫烘干粉碎，過100目篩，放入干燥器備用，用于測定總黃酮含量。

1.3 脅迫因子對大吳風草總黃酮含量的影響

1.3.1 不同光照下大吳風草的黃酮含量 從樣地中挖取大小一致的大吳風草苗，移植于花盆中，土壤為原樣地的土壤，花盆規(guī)格一致。在陰涼處緩苗1周，待苗生長良好后用于試驗。光照梯度設置為全光照、一層遮陽網(wǎng)(50000 lux)、二層遮陽網(wǎng)(30000 lux)3個梯度。培養(yǎng)30 d后測定其根狀莖、葉柄、葉片中的總黃酮含量。

1.3.2 不同水分脅迫條件下大吳風草的黃酮含量 首先測定樣地中的土壤水分含量，并以其為對照土栽植的大吳風草作為對照組樣品。水分脅迫設置3個梯度，即重度、中度、輕度脅迫，其含水量分別為田間持水量的80%、60%、30%。脅迫處理30 d后測定其總黃酮的含量。

1.3.3 不同鹽濃度脅迫條件下大吳風草的總黃酮含量 以野生樣地土為對照，分別設100 mmol/L、200 mmol/L和 300 mmol/L 3個鹽度梯度，脅迫時間21 d后測定其總黃酮含量。

1.3.4 不同溫度對大吳風草總黃酮含量的影響 采集大小一致的2年生大吳風草苗，分別將其栽入花盆，然后放于 5℃、15℃、20℃、25℃、30℃的光照培養(yǎng)箱中，每個梯度5個重復。每天定時加水，使土壤恒重。7 d后測定總黃酮含量。

1.4 試驗方法 精確稱定樣品粉末0.5 g左右，置于50 ml容量瓶中，加95%乙醇40 ml，在超聲波發(fā)生器提取45 min，靜置冷卻，加95%乙醇至刻度，搖勻，靜止3～4 h后，吸取樣液2.0 ml，分別置于25 ml容量瓶中，加水至 5 ml，再加5%亞硝酸鈉1.0 ml，搖勻放置6 min，加入10%的硝酸鋁1.0 ml，搖勻放置5 min，加入5%氫氧化鈉10.0 ml，混勻后用水定容至刻度，搖勻，放置15 min以上，以相應試劑做空白，于510 nm處測定吸光度。從標準曲線中得到提取液黃酮的含量。

2 結(jié)果

2.1 大吳風草總黃酮含量的季節(jié)變化動態(tài)

大吳風草各個器官總黃酮含量隨季節(jié)變化規(guī)律如圖1所示，葉片、葉柄與根狀莖總黃酮含量差異顯著(F=12.00908，P ＜0.05)，葉片總黃酮含量最高，隨著季節(jié)的變化有逐漸增高的趨勢。4月份最低，10月份比4月份增加了24.33%，冬季12月份葉片的總黃酮含量最高，比10月份增加了25.81%。葉柄的總黃酮含量高于根狀莖，而且葉柄與根狀莖總黃酮含量隨著季節(jié)的變化而呈波動狀態(tài)，有2個高峰，1個在6月份，另1個在10月份。與葉片的總黃酮變化趨勢比較，葉柄與根狀莖總黃酮含量8月份較低，相對于6月份分別降低了1.4%、24%，而冬季12月份最低，相對于10月份分別降低了13.38%、19.09%。

2.2 不同脅迫條件下大吳風草總黃酮含量的變化

圖1 大吳風草各個器官總黃酮含量的季節(jié)變化Fig.1 Seasonal variation of the total flavonoid content of Farfujium japonicum in various organs

2.2.1 不同光照條件下大吳風草總黃酮含量的變化 光照是影響植物細胞生長及次生代謝產(chǎn)物積累的重要環(huán)境因子之一，不同光照條件下植物體內(nèi)黃酮含量明顯不同［6］。從表1可以看出大吳風草葉片黃酮含量，隨著光照的增強而降低，但差異無統(tǒng)計學意義(F=1.6574，P＞0.05)。全光照下葉片黃酮含量相對于30000 lux光照強度時減少了18.8%，相對于50000 lux光照強度時減少了16.3%。葉柄與根狀莖隨著光照的增強，黃酮含量也呈降低的趨勢;但是，由于大吳風草葉片較大，對葉柄有較好的遮陰作用，光照的增強對葉柄影響不大，所以其黃酮含量變化較小，全光照下葉柄黃酮含量相對于30000 lux光照強度時減少了12.9%;相對于50000 lux光照強度時減少了10.1%。大吳風草根狀莖藏于地下，受光強直接影響較小，但其黃酮含量與葉片的黃酮含量相關，一般認為黃酮是由葉片合成后運輸?shù)礁康模?］。葉片黃酮含量隨著光的增強而降低，葉片合成黃酮能力減弱，根狀莖的黃酮含量也將減少。

2.2.2 不同水分脅迫條件下大吳風草總黃酮含量的變化 水是植物代謝所必需的物質(zhì)，它直接影響的往往是植物的初生代謝，通過初生代謝進一步影響次生代謝［8］。從表2中可以看出大吳風草葉片的黃酮含量隨著土壤含水量的降低而呈增高的趨勢。輕度水分脅迫、中度水分脅迫、重度水分脅迫相對于對照組黃酮含量分別增加了13.4%、18.8%、29.4%。隨著土壤含水量的降低大吳風草葉柄的黃酮含量呈先增高而后降低趨勢，中度水分脅迫時葉柄黃酮含量達到最大，比對照組增加了7.8%，重度脅迫時葉柄黃酮含量開始降低，比中度脅迫時降低了13.3%。大吳風草根狀莖黃酮含量隨土壤含水量的降低而降低，重度水分脅迫、中度水分脅迫、輕度水分脅迫相對于對照組黃酮含量分別降低了 24.61%、19.84%、8.4%。

表1 不同光照條件下大吳風草總黃酮含量Table 1 Under different light conditions total flavonoid content Farfujium japonicum

表2 不同水分條件下大吳風草黃酮總含量Table 2 Under different water conditions total flavonoid content Farfujium japonicum

2.2.3 不同鹽濃度脅迫下大吳風草總黃酮含量 從表3中可以看出，隨著鹽脅迫濃度的增加，大吳風草葉片、葉柄、根狀莖的總黃酮含量均呈下降趨勢。以野外自然生長的大吳風草土壤鹽度為對照(50 mmol/L)，鹽度在300 mmol/L、200 mmol/L、100 mmol/L 時葉片的總黃酮含量相對于對照組分別降低了19.37%、4.8%、1.9%;葉柄的總黃酮含量相對于對照組分別降低了 36.29%、26.82%、6.97%;根狀莖總黃酮含量相對于對照組降低了52.61%、40.42%、24.92%。由上述結(jié)果可知，鹽脅迫能顯著降低大吳風草總黃酮的含量，高鹽度環(huán)境可能阻礙黃酮的合成。

2.2.4 不同溫度對大吳風草各個器官總黃酮含量的影響 如圖2所示，大吳風草葉片總黃酮含量隨著溫度的升高而增高，30℃時相對于5℃增加了41.47%;葉柄總黃酮含量表現(xiàn)為先降低而后增高，15℃時相對于 5℃降低了13.02%，30℃ 時相對于 15℃ 增加了 34.58%;而根狀莖總黃酮含量表現(xiàn)為先增高而后降低的趨勢，25℃時達到最高，相對于 5℃增加了41.88%，30℃相對于 25℃降低了 19.89%。

表3 不同鹽濃度脅迫下大無風草總黃酮含量Table 3 Under different salt stress total flavonoid content Farfujium japonicum

圖2 不同溫度對大吳風草總黃酮含量的影響Fig.2 Different temperatures on the total flavonoid content of Farfujium japonicum

3 討論

3.1 不同生長季大吳風草總黃酮含量的變化從發(fā)育進程的植物生理變化規(guī)律看，營養(yǎng)生長期初生代謝旺盛，次生代謝處于低谷;到生殖生長期，由于開花傳粉等生理過程需要葉不斷合成并轉(zhuǎn)移一些生理調(diào)節(jié)物質(zhì)，因而，次生代謝漸漸加強;當生長高峰期過后，次生代謝在大量初生代謝中間產(chǎn)物的激活下達到高峰，次生物質(zhì)含量顯著增加［9］。大吳風草4～8月為營養(yǎng)生長期，各個器官的總黃酮含量雖有所增加，但變化不大，8～10月進入花期總黃酮含量急劇增加，而且葉柄與根狀莖增加幅度大于葉片，10月份以后大吳風草進入果期，根狀莖與葉柄的總黃酮含量開始下降，而葉片的總黃酮含量卻急劇增高。進入冬季后根狀莖和葉柄中黃酮類物質(zhì)含量明顯降低，主要原因可能是溫度太低直接影響到合成途徑中關鍵酶的活性［10］。葉片中黃酮類物質(zhì)含量卻明顯增加，可能由于落葉林落葉后，冬季林內(nèi)郁閉度明顯減小，大吳風草葉片受紫外線輻射強，有益于葉片黃酮類物質(zhì)積累［11］。

3.2 生態(tài)因子對大吳風草總黃酮含量的影響

植物的代謝包括初生代謝與次生代謝［11-12］。黃酮類化合物是植物在長期的生態(tài)適應過程中為抵御惡劣生態(tài)條件、動物、微生物等攻擊而形成的一大類次生代謝產(chǎn)物［5］。植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的合成與積累需要環(huán)境條件的誘導［13］，環(huán)境中許多因子，如季節(jié)變化、輻射強度、營養(yǎng)狀況、微生物侵害、機械損傷以及植物種間競爭等，都會對植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的代謝及分布產(chǎn)生很大影響。光照強弱直接影響黃酮含量。以往的研究往往認為，隨著光強的增強，葉片的黃酮含量將隨著增加。如曹建國等比較了生長于林內(nèi)、林隙和林緣3種生境的刺五加(Acanthopanax senticosus)葉片的總黃酮，發(fā)現(xiàn)林內(nèi)生長的植物體內(nèi)總黃酮含量最低，林隙植物有所增加，林緣生長的植物含量最高［14］。但是也有學者認為，適當?shù)恼诠庥欣邳S酮合成與積累［15］。朱肖峰等(2009年)認為，馬蹄金的葉片黃酮含量當光強超過一定大小時而呈降低的趨勢［16］。從本研究可以看出，隨著光強的增加，大吳風草葉片總黃酮含量呈下降趨勢，說明大吳風草為耐陰性植物，其光飽和點可能較低，當光強超過一定強度時，其光合能力下降，從而也影響次生代謝物質(zhì)黃酮的合成與運輸。由于葉柄及根狀莖的黃酮來自于葉片合成與運輸，所以隨著光強的增強其黃酮含量呈降低趨勢。

大吳風草葉由于是耐陰植物，在陽生環(huán)境仍然能生長，但是光合產(chǎn)物多數(shù)用于合成次生代謝產(chǎn)物，所以黃酮含量隨脅迫強度的增加而增加［5］。根狀莖的黃酮含量隨水分脅迫的加劇而減少，可能是在水分脅迫下，葉片制造的次生代謝產(chǎn)物不能及時運輸?shù)礁鶢钋o。蔡娜(2008年)研究了苦蕎麥幼苗的黃酮含量隨干旱脅迫的加劇而增加［17］。石進校等人對干旱脅迫下淫羊藿總黃酮含量變化進行了研究，結(jié)果表明干旱脅迫后黃酮含量升高，并證明黃酮含量與淫羊藿早期抗旱性之間有明顯相關性［18］。本實驗研究結(jié)果與前人是一致的。陳光登等研究了2種淫羊藿屬植物黃酮含量隨著鹽度的增加，呈先增高而后降低［19］。管藍芳等也認為，低濃度鹽能夠促進飛廉懸浮細胞的黃酮含量，高濃度鹽脅迫下，黃酮含量降低［20］。大無風草的總黃酮含量隨鹽度的增加而減少，說明大吳風草耐鹽性較差，在較低的鹽濃度條件下植物已經(jīng)遭受鹽毒害，所以黃酮合成下降。

總而言之，大吳風草葉片的總黃酮含量隨季節(jié)變化而增加，葉柄及根狀莖的總黃酮含量雖季節(jié)變化而呈波動狀態(tài)，隨著光強的增強，大吳風草葉片、葉柄、根狀莖的黃酮含量呈下降趨勢;隨著水分脅迫強度的增加，大吳風草葉片黃酮含量逐漸增加，而葉柄的黃酮含量先升高而后降低，根狀莖的黃酮含量逐漸降低;隨著鹽脅迫程度的加深，大吳風草葉片、葉柄、根狀莖的黃酮含量均呈下降趨勢。溫度對大吳風草各個器官總黃酮含量影響不同。

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