枯否細(xì)胞在高脂誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗中的作用*

李樹穎 張 怡 郭玉璽 李 晶 潘從清

研究顯示，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是一種慢性炎癥狀態(tài)，巨噬細(xì)胞在肥胖脂肪組織的浸潤、激活參與脂肪組織IR發(fā)生的觀點已被接受[1]，但枯否細(xì)胞（Kupffer cells，KCs）是否參與高脂誘導(dǎo)的肝臟IR還存在爭議。本研究擬通過對不同階段高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟炎性因子表達(dá)的檢測，觀察其與肝臟IR發(fā)生的關(guān)系，探討KCs在高脂誘導(dǎo)的肝臟IR中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級C57BL/6J小鼠84只，6周齡，體質(zhì)量（15.62±3.14）g，雄性，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表將小鼠隨機(jī)分為普食組和高脂組，每組42只，每組內(nèi)再隨機(jī)分為7小組，每組6只。分別給予普食（脂肪占飼料熱量組成的6.2%）和高脂（脂肪占飼料熱量組成的59.3%）喂養(yǎng)。

1.2.2 血清胰島素檢測 6組普食和6組高脂小鼠分別在喂養(yǎng)第1、2、4、8、12和16周處死小鼠前空腹尾靜脈取血，于4℃3 000 r/min離心10 min，取上清-80℃保存，按照小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（shibayagi株式會社，日本）說明書操作檢測小鼠血清胰島素含量。

1.2.3 葡萄糖耐量試驗 1組普食和1組高脂小鼠分別在普食和高脂喂養(yǎng)后1、2、4、8、12和16周行葡萄糖耐量檢測，小鼠實驗前一晚去除飼料，更換鼠籠、墊料，可自由飲用水，饑餓過夜16 h，次日晨輕剪鼠尾，血糖儀檢測血糖后稱質(zhì)量，按1 g/kg腹腔注射葡萄糖溶液，分別在注射后15、30、60、120 min取血檢測血糖。計算葡萄糖曲線下面積（AUG）＝1/4×空腹值＋1/2×15 min值＋3/4×30 min值＋60 min值＋1/2×120 min值。

1.2.4 Western blot檢測肝組織蛋白表達(dá) 分別在喂養(yǎng)第1、2、4、8、12和16周處死小鼠取肝臟，-80℃凍存。取肝組織0.1 g勻漿，RIPA細(xì)胞裂解液提取肝組織總蛋白，BSA法測定蛋白濃度。取60 μg蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)膜，封閉，免疫印跡法分別檢測抗蛋白激酶B絲氨酸473（Akt-ser473）抗體、抗胰島素受體底物1絲氨酸307（IRS1-ser307）抗體、抗核糖體蛋白S6激酶1蘇氨酸389（S6K1-thr389）抗體、抗β肌動蛋白（βactin）抗體（均為1∶1 000稀釋，Cell signaling公司，美國）或磷酸化c-Jun氨基末端激酶抗體（p-JNK,1∶1 000稀釋，Santa公司，美國），4℃孵育過夜，羊抗兔IgG-HRP二抗（1∶5 000，Santa cruz公司，美國）室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯影，X線膠片壓片曝光，用Image J軟件處理，各蛋白的磷酸化相對表達(dá)量=磷酸化的蛋白水平灰度值/相對應(yīng)β-actin灰度值。

1.2.5 單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-10 mRNA表達(dá)水平 Trizol提取肝組織總RNA。取2 μg總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）合成cDNA，利用SYBR Green（羅氏公司，德國）在ABI7500實時定量-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列β-actin 上游 5＇-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3＇，下游 5＇-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3＇；MCP-1上游 5＇-GCAGT?TAACGCCCCACTCA-3＇，下游 5＇-CCCAGCCTACTCATT?GGGATCA-3＇；TNF-α上游5＇-CGTCGTAGCAAACCACCAA-3＇，下游5＇-GAGAACCTGGGAGTAGACAAGG-3＇；IL-1β上游 5＇-ATCACTCATTGTGGCTGTGG-3＇，下游 5＇-GTCGTTGCTTG?GTTCTCCT-3＇；IL-10 上游 5＇-GCGTCGTGATTAGCGAT?GATG-3＇，下游 5＇-CTCGAGCAAGTCTTTCAGTCC-3＇。擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL體系：SYBR Green PCR混合物12.5 μL，上游引物 1 μL（10 μmol/L），下游引物1 μL（10 μmol/L），cDNA 5 μL，加雙蒸水至25 μL。反應(yīng)條件為：模板cDNA 94℃變性4 min后進(jìn)行循環(huán)，變性94℃15 s，退火60℃10 s，延伸72℃10 s，共40個循環(huán)。記錄目的基因Ct值和內(nèi)參照基因Ct值，根據(jù)實時定量-PCR相對定量的2-△Ct法計算目的基因表達(dá)的相對值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組比較采用t檢驗，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間小鼠血清胰島素水平比較 高脂喂養(yǎng)小鼠后1、2周，2組小鼠血清胰島素差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在第4、8、12和16周時，高脂組小鼠血清胰島素水平均高于普食組（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

Table 1 Comparison of serum insulin levels in different time points between two groups表1 不同時間2組小鼠血清胰島素水平比較（n=6，μg/L，x±s）

2.2 不同時間2組小鼠葡萄糖耐量曲線下面積比較 和普食組相比，高脂組1、2、4、8、12、16周的葡萄糖耐量曲線下面積均增大（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

Table 2 Comparison of areas under the curve of glucose tolerance test between two groups表2 2組小鼠葡萄糖耐量試驗曲線下面積比較（n=6，mmol·L-1·min-1，x±s）

2.3 不同時間2組小鼠肝臟IRS-1、S6K1、Akt、JNK磷酸化表達(dá)比較 與普食組相比，高脂組小鼠肝臟IRS1-ser307、S6K1-thr389（第4～16周）、p-JNK表達(dá)增強(qiáng)（2～16周），Akt-ser473（8～16周）表達(dá)減弱，見圖1。1～2周時，2組小鼠IRS1-ser307、S6K1-thr389相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），第4～16周高脂組高于普食組（均P＜0.01），見表3、4。1～4周時，2組小鼠Akt-ser473相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），第8～16周時高脂組低于普食組（均P＜0.01），見表5。第2～16周時，高脂組小鼠p-JNK相對表達(dá)量均高于普食組（均P＜0.01），見表6。

Figure1 Comparison of phosphorylation state of hepatic IRS-1,S6K1,Akt and JNK expressions in different feeding time between two groups of mice圖1 不同時間2組小鼠肝臟IRS-1、S6K1、Akt、JNK磷酸化表達(dá)比較

Table 3 Comparison of relative expression levels of hepatic IRS1-ser307 between two groups of mice表3 2組小鼠肝臟IRS1-ser307相對表達(dá)量比較（n=6，x±s）

Table 4 Comparison of relative expression levels of hepatic S6K1-thr389 between two groups of mice表4 2組小鼠肝臟S6K1-thr389相對表達(dá)量比較（n=6，x±s）

Table 5 Comparison of relative expression levels of hepatic Akt-ser473 between two groups of mice表5 2組小鼠肝臟Akt-ser473相對表達(dá)量比較（n=6，x±s）

Table 6 Comparison of relative expression levels of hepatic p-JNK between two groups of mice表6 2組小鼠肝臟p-JNK相對表達(dá)量比較（n=6，x±s）

2.4 不同時間2組小鼠炎性因子表達(dá)變化 1周時，2組小鼠MCP-1、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），第2～16周時，高脂組上述指標(biāo)表達(dá)量均高于普食組（均P＜0.01），見表7～9。而第1～2周時2組抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），第4～16周時，高脂組低于普食組（均P＜0.01），見表10。

Table 7 Comparison of hepatic MCP-1 mRNA expression between two groups of mice表7 2組小鼠肝臟MCP-1 mRNA表達(dá)的比較（n=6，x±s）

3 討論

3.1 巨噬細(xì)胞在IR中發(fā)揮作用 巨噬細(xì)胞可分為“傳統(tǒng)”激活巨噬細(xì)胞（M1型）和“選擇”激活巨噬細(xì)胞（M2型）2種，M1型主要分泌TNF-α、IL-1β等炎性因子；M2型主要分泌IL-10等抗炎因子，炎性因子可激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路引起胰島素受體底物（IRS）1絲氨酸磷酸化增加，導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)障礙[2]；IL-10則通過抑制轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3（STAT3）在胰島素信號中發(fā)揮保護(hù)作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)小鼠1周，脂肪組織巨噬細(xì)胞（adipose tissue macrophage，ATM）即開始在脂肪組織浸潤，且隨喂養(yǎng)時間及肥胖增加而浸潤加重[4]，在此過程中ATM表型由抗炎的M2型向致炎的M1型轉(zhuǎn)變，且與IR的程度一致[5]。KCs是肝臟巨噬細(xì)胞，其是否同ATM一樣在肝臟IR中發(fā)揮作用目前還存在爭議。

Table 8 Comparison of hepatic TNF-α mRNA expression between two groups of mice表8 2組小鼠肝臟TNF-α mRNA表達(dá)的比較（n=6，x±s）

Table 9 Comparison of hepatic IL-1β mRNA expression between two groups of mice表9 2組小鼠肝臟IL-1β mRNA表達(dá)的比較（n=6，x±s）

Table 10 Comparison of hepatic IL-10 mRNA expression between two groups of mice表10 2組小鼠肝臟IL-10 mRNA表達(dá)的比較（n=6，x±s）

3.2 KCs參與肝臟IR的發(fā)生 本研究發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)小鼠第2～16周炎性因子TNF-α、IL-1β mRNA在肝臟表達(dá)高于普食組，抗炎因子IL-10 mRNA第4～16周表達(dá)低于普食組。Western blot結(jié)果也顯示高脂飲食喂養(yǎng)第2周，高脂組小鼠肝臟炎性信號p-JNK相對表達(dá)量高于普食喂養(yǎng)小鼠，顯示高脂飲食引起小鼠肝臟處于炎性狀態(tài)。第4周開始，高脂組肝臟IRS1-307、S6K1-thr389相對表達(dá)量高于普食組；第8周高脂組Akt-ser473相對表達(dá)量開始低于普食組，提示出現(xiàn)肝臟IR。MCP-1可趨化循環(huán)中的單核細(xì)胞進(jìn)入肝臟轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞[6]。本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠喂養(yǎng)第2周開始，高脂組MCP-1 mRNA表達(dá)開始高于普食組，推測高脂飲食可能通過征募單核細(xì)胞進(jìn)入肝臟引起KCs在肝臟浸潤增加，并促進(jìn)肝臟M1型KCs釋放炎性因子、抑制M2型KCs釋放抗炎因子，通過影響肝臟胰島素信號從而引起了肝臟IR的發(fā)生。另外，本研究發(fā)現(xiàn)高脂還可引起血清胰島素水平增加，造成小鼠對葡萄糖代謝能力的下降，推測高脂造成的肝臟IR可引起肝糖原合成能力下降，從而在糖耐量異常中發(fā)揮一定作用。

3.3 飽和脂肪酸促進(jìn)肝臟IR 近年來有研究認(rèn)為KCs介導(dǎo)了高脂誘導(dǎo)的肝臟IR[7]，但也有研究認(rèn)為其保護(hù)肝臟免于高脂誘導(dǎo)的IR[8]。高脂飲食中的飽和脂肪酸成分可激活M1巨噬細(xì)胞介導(dǎo)IR[9]，而單不飽和脂肪酸則激活M2巨噬細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[10]，不同的研究結(jié)果可能與高脂中的飲食成分有關(guān)。本研究使用的高脂飲食以豬油為主，為飽和脂肪酸，故通過激活M1型KCs細(xì)胞、抑制M2型KCs介導(dǎo)肝臟IR的發(fā)生。

綜上所述，在營養(yǎng)過剩條件下，高脂飲食可能通過調(diào)節(jié)M1型KCs分泌炎性因子TNF-α、IL-1β，抑制M2型KCs分泌抗炎因子IL-10在肝臟IR中發(fā)揮作用。但高脂是通過何種途徑在肝臟誘導(dǎo)該改變的發(fā)生有待進(jìn)一步研究。

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