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    三七三醇皂苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用*

    2013-12-03 03:50:52朱德淼劉學(xué)政
    天津醫(yī)藥 2013年11期
    關(guān)鍵詞:三醇皂苷孵育

    朱德淼 劉學(xué)政

    糖尿病可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal gangli?on cell,RGC)凋亡,引發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR),是成年人視力減退甚至失明的重要原因之一[1]。三七三醇皂苷(Panax notoginseng,PTS)是中藥三七的重要活性成分,可改善腦缺血所致的腦體積縮小及神經(jīng)功能缺損,有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[2-3]。本研究擬探討PTS對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC的影響及其作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料 30只SD大鼠雌雄不限,體質(zhì)量200~230 g,購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;PTS購(gòu)自成都華神集團(tuán)股份有限公司制藥廠;鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、羊抗大鼠Nogo受體一抗、小鼠抗大鼠Brn3a一抗、A594-驢抗羊二抗及A488-驢抗小鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;MDA試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物公司。

    1.2 糖尿病模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病組和治療組,每組10只。糖尿病組和治療組腹腔注射1%STZ溶液(60 mg/kg),48 h后尾靜脈取血測(cè)血糖,若大于16.7 mmol/L即為模型建立成功。治療組給予PTS 50 mg·kg-1·d-1灌胃給藥,每日2次。對(duì)照組及糖尿病組給予等劑量生理鹽水。1個(gè)月后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

    1.3 Nogo受體及Brn3a熒光免疫組化雙標(biāo) 快速摘除大鼠雙側(cè)眼球,于解剖顯微鏡下,以眼科剪沿角膜緣剪開(kāi)眼球,去除角膜、晶狀體及玻璃體,剝離視網(wǎng)膜,濾紙吸干后稱質(zhì)量。常規(guī)制備視網(wǎng)膜石蠟切片,脫蠟至水化。以羊抗大鼠Nogo受體/小鼠抗大鼠Brn3a一抗混合液于4℃孵育48 h,均稀釋為1∶200(Brn3a為RGC特異性標(biāo)志物),再以A594-驢抗羊/A488-驢抗小鼠二抗混合液孵育室溫4 h(均稀釋為1∶500),封片,熒光顯微鏡下觀察。

    1.4 Western blot檢測(cè)Nogo受體表達(dá) 將視網(wǎng)膜以4℃生理鹽水制備1%濃度組織勻漿。蛋白裂解液裂解后以12 000 r/min離心15 min,上清液以80 V電壓聚丙烯酰胺凝膠電泳,半干法移至PVDF膜,以Nogo受體及β-actin一抗于37℃分別孵育2 h,再以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫分別孵育1 h,試劑盒顯影。Nogo與β-actin條帶光密度值之比即為Nogo受體相對(duì)表達(dá)量。

    1.5 視網(wǎng)膜丙二醛(MDA)含量檢測(cè) 以4℃生理鹽水制備5%的視網(wǎng)膜勻漿,4 000 r/min離心10 min后取上清,按試劑盒提供的操作步驟及公式,利用硫代巴比妥酸法檢測(cè)視網(wǎng)膜中MDA含量。

    1.6 視網(wǎng)膜HE染色 常規(guī)制備視網(wǎng)膜石蠟切片,脫蠟入水,經(jīng)蘇木精染色、分色、水洗、乙醇伊紅染色液染色、乙醇逐級(jí)脫水及二甲苯透明等常規(guī)步驟,封片后鏡下觀察,每個(gè)視網(wǎng)膜隨機(jī)讀取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)3次,取平均值,計(jì)算各組RGC密度。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)以x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠血糖水平 造模48 h后,糖尿病組及PTS治療組血糖明顯高于對(duì)照組(均P<0.001),糖尿病模型構(gòu)建成功,見(jiàn)表1。

    Table 1 Comparison of blood glucose,expression of Nogo receptor,the level of MDA,and density of RGC between three groups表1 3組大鼠血糖、視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)、MDA含量及RGC密度比較 (n=10,x±s)

    2.2 Brn3a和Nogo受體表達(dá)情況 熒光免疫組化雙標(biāo)顯示,Brn3a與Nogo受體于視網(wǎng)膜內(nèi)大量共存,見(jiàn)圖1。

    2.3 PTS對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)的影響 糖尿病組Nogo受體表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)表1、圖2。

    Figure 2 Expression levels of retinal Nogo receptor in three groups圖2 各組視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)

    2.4 PTS對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜MDA含量的影響 3組間MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),糖尿病組高于對(duì)照組和治療組(均P<0.001),見(jiàn)表1。

    2.5 PTS對(duì)糖尿病大鼠RGC密度的影響 糖尿病組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層RGC密度較對(duì)照組和治療組明顯減少(P<0.001),見(jiàn)表1、圖3。

    3 討論

    糖尿病累及視網(wǎng)膜即發(fā)生DR,視網(wǎng)膜RGC受損是DR患者視力減退的重要原因[4]。糖尿病患者DR發(fā)病率高,即使嚴(yán)格控制血糖也不能完全防治DR,患者仍有視力減退甚至失明的危險(xiǎn)。糖尿病病程5年患者DR發(fā)病率約為44.4%,7年約為56%左右,10年約60%,15年則高達(dá)80%[5-6]。預(yù)計(jì)2030年全球糖尿病患者將達(dá)3億6千萬(wàn)[7],DR已經(jīng)成為成年人致盲的重要因素[8]。

    三七是一種傳統(tǒng)中藥,PTS是三七的重要活性成分之一。本研究發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC數(shù)量明顯減少,給予PTS可恢復(fù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC數(shù)量,表現(xiàn)出了明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。

    PTS保護(hù)缺血腦神經(jīng)元的機(jī)制尚不完全清楚,可能與PTS抑制神經(jīng)元Nogo受體及其配體Nogo-A的表達(dá),促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)再生有關(guān)[2-3]。Nogo受體是一種髓磷脂相關(guān)蛋白,可抑制神經(jīng)再生,在視網(wǎng)膜僅表達(dá)于RGC細(xì)胞內(nèi)[9]。本研究也發(fā)現(xiàn),Nogo受體與Brn3a在視網(wǎng)膜內(nèi)大量共存,僅表達(dá)于視網(wǎng)膜RGC內(nèi)。青光眼時(shí)視網(wǎng)膜RGC細(xì)胞Nogo受體表達(dá)增加,抑制Nogo受體表達(dá)可抑制RGC細(xì)胞凋亡,Nogo受體表達(dá)增加是視網(wǎng)膜RGC凋亡的重要機(jī)制之一[10]。本研究結(jié)果顯示,PTS恢復(fù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC數(shù)量的同時(shí),視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)減少,提示下調(diào)Nogo受體表達(dá)可能是PTS保護(hù)糖尿病視網(wǎng)膜RGC的重要機(jī)制之一。

    Nogo受體抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)雜,可影響線粒體膜電位,是細(xì)胞氧自由基堆積,導(dǎo)致凋亡的重要因素之一[11]。因此,Nogo受體可能通過(guò)氧自由基堆積誘導(dǎo)RGC細(xì)胞凋亡。高血糖可誘發(fā)氧化應(yīng)激,MDA水平是氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)之一。本研究表明,糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜MDA水平增高,說(shuō)明糖尿病視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激明顯。PTS下調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)的同時(shí),伴有視網(wǎng)膜MDA含量的降低,表明PTS下調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)的同時(shí)可降低視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平。因此,PTS可能通過(guò)下調(diào)RGC內(nèi)Nogo受體的表達(dá),抑制RGC氧化應(yīng)激反應(yīng),從而對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜RGC發(fā)揮保護(hù)作用。

    本研究證實(shí)了PTS對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC的保護(hù)作用,并研究了作用機(jī)制,為DR的臨床治療提供了思路,但DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,PTS在DR防護(hù)中的作用仍需深入探討。

    Figure 1 Colocalization of Brn3a and Nogo receptor in retina(immunofluorescence histochemical double-staining×200)圖1 Brn3a與Nogo受體在視網(wǎng)膜內(nèi)的共存(熒光免疫組化雙標(biāo),×200)

    Figure 3 Photos showing the number of RGC in three groups of diabetic rats(HE staining,×200)圖3 3組糖尿病大鼠RGC密度(HE染色,×200)

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