IGF2在小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為胰島樣細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá)*

劉 峰 湯佳珍 朱凌燕 甘華俠

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES細(xì)胞)具有無(wú)限增殖和全能分化的潛力，理論上ES細(xì)胞具有分化為各種細(xì)胞的潛能[1]，目前已成功將ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多種終末組織細(xì)胞，成為細(xì)胞和器官移植領(lǐng)域最具潛在優(yōu)勢(shì)的資源[2-3]?；蚪M印跡是指某些基因呈不遵從孟德?tīng)柖梢揽繂斡H傳遞某些遺傳學(xué)性狀的現(xiàn)象，也就是某些基因呈親源依賴(lài)性單等位基因表達(dá)[4]，是目前表觀(guān)遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容之一。有研究顯示，體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的ES細(xì)胞，其表觀(guān)遺傳學(xué)呈現(xiàn)不穩(wěn)定趨勢(shì)[5]。經(jīng)體外受精（IVF）得到的ES細(xì)胞，存在基因組印跡異常[6]。鼠胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）2基因位于7號(hào)染色體上，是最早發(fā)現(xiàn)的印跡基因，胰腺的IGF2只從父本染色體表達(dá)。本研究旨在通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)，檢測(cè)印跡基因IGF2在誘導(dǎo)分化細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討體外誘導(dǎo)培養(yǎng)對(duì)基因組印跡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠ES細(xì)胞系由美國(guó)斯坦福大學(xué)Andrew.R.Hoffman惠贈(zèng)。試劑：Knock-out DMEM、DMEM/F12、L-谷氨酰氨、胎牛血清（FBS）和TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司，白血病抑制因子（LIF）購(gòu)自Chemicon公司，全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，RA）和尼克酰胺（nicotinamide，NIC）購(gòu)自Sigma公司，N2添加物、B27添加物購(gòu)自GIBCOBRL公司，Activin A購(gòu)自Ramp;D公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq DNA聚合酶購(gòu)自Fer?menta公司，限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自NEB公司，胰島素單克隆抗體購(gòu)自abcam公司，C肽單克隆抗體購(gòu)自L(fǎng)icon公司。

1.2 方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)分化后胰島細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)情況 按常規(guī)法培養(yǎng)擴(kuò)增ES細(xì)胞，參照Shi等[7]的三階段法誘導(dǎo)培養(yǎng)。分化各階段細(xì)胞總RNA按TRIzol說(shuō)明書(shū)提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列及PCR的條件見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為10 μL，具體如下：10×緩沖液1.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)0.8 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.2 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL，引物（10 μmol/L，正反引物Mix）0.2 μL，cDNA模板(0.1 g/L)0.2 μL，ddH2O 7.6 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min后，94 ℃變性30 s，60℃（β-actin為58℃）退火30 s，72℃延伸30 s，完成30個(gè)循環(huán)，72℃5 min，瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下攝像觀(guān)察。

Table 1 The primer sequence of islet-specific genes表1 胰島細(xì)胞特異表達(dá)基因引物序列

1.2.2 免疫熒光染色 分化成熟的第3階段細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè)胰島素及C肽，收集的分化細(xì)胞用PBS洗去細(xì)胞中的培養(yǎng)基，加4%的多聚甲醛溶液室溫下固定細(xì)胞；加一抗，室溫1 h或4℃過(guò)夜孵育，加磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3遍；孵育二抗，室溫孵育1 h；PBS洗4次，每次5～10 min，然后用5%BSA室溫封閉30 min；加DAPI（1∶1 000稀釋?zhuān)┤竞?，室溫避光孵? min，用PBS清洗2遍；將DAPI/Antifade Solution稀釋30倍，滴適量到蓋玻片上，室溫染色20 min；PBS洗3次，每次5 min；封片劑封片，37℃烤片10 min，激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。

1.2.3 PCR-RFLP法分析誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞印跡基因IGF2親本表達(dá) 以分化前后細(xì)胞cDNA為模板，用特異性引物擴(kuò)增印跡基因 IGF2，引物序列：5＇-TGGCCCTCCTGGAGA?CRTACTGTGC-3＇，5＇-CTGTCCCTGCTCAAGAGGAGGTCA-3＇，PCR產(chǎn)物（380 bp）用特異的限制性?xún)?nèi)切酶（BsaAI）；酶切產(chǎn)物（380、321、59 bp）在2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，溴乙錠染色，紫外投射儀上觀(guān)察電泳結(jié)果并攝像。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)分化各階段細(xì)胞胰島細(xì)胞性標(biāo)志物的表達(dá)情況 胰島素、胰高糖素、生長(zhǎng)抑素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2在未分化的ES細(xì)胞中不表達(dá)，在誘導(dǎo)分化第2階段末和第3階段末的細(xì)胞都有表達(dá)，且在第3階段比第2階段要強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

2.2 最終分化細(xì)胞特異性蛋白表達(dá) 誘導(dǎo)分化終末細(xì)胞能表達(dá)胰島細(xì)胞特異性激素蛋白胰島素和C肽，見(jiàn)圖2。

Figure 1 The expression of specific marker genes at different stages in islet cells圖1 胰島細(xì)胞標(biāo)志基因在誘導(dǎo)分化各階段的表達(dá)情況

2.3 PCR-RFLP檢測(cè)印跡基因表達(dá)結(jié)果 印跡基因IGF2在分化終末的胰島樣細(xì)胞中呈雙等位基因表達(dá)，見(jiàn)圖3。

Figure 3 The expression of IGF2 at different stages圖3 分化前后細(xì)胞印跡基因表達(dá)情況

3 討論

ES細(xì)胞作為個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育最早階段來(lái)源的細(xì)胞，其分化的整個(gè)過(guò)程其實(shí)就是表觀(guān)遺傳調(diào)控基因表達(dá)的過(guò)程，遺傳物質(zhì)不變，其表型卻可以有多種形式。環(huán)境因素、體外操作及內(nèi)分泌因素的變化也對(duì)IGF2的印跡及胎盤(pán)和胎兒的發(fā)育有一定的影響。IGF2/H19的表觀(guān)遺傳修飾在早期發(fā)育時(shí)也容易受到環(huán)境頻繁變化的影響，尤其是胚外組織[8]。應(yīng)用乙醇處理胎盤(pán)發(fā)現(xiàn)，父系等位基因甲基化程度顯著低于生理鹽水處理的胎盤(pán)，提示外界因素對(duì)IGF2的印跡以及胎盤(pán)發(fā)育產(chǎn)生影響[9]。

本研究中ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中應(yīng)用了Ac?tivin A和RA。Activin A是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）超家族的一種二硫化物穩(wěn)定蛋白，與細(xì)胞表面受體結(jié)合后誘導(dǎo)許多基因表達(dá)，對(duì)限定性?xún)?nèi)胚層的早期分化具有重要作用[10]。尤其胚胎干細(xì)胞在高濃度的Ac?tivin A培養(yǎng)作用下能大規(guī)模的向限定性?xún)?nèi)胚層細(xì)胞分化[11]。RA是神經(jīng)外胚層和中胚層前腸尾端化特征性的信號(hào)分子[12]。RA為胚胎發(fā)育和細(xì)胞功能維持所必需，參與誘導(dǎo)細(xì)胞分化和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。有研究表明，RA能夠調(diào)節(jié)胚胎內(nèi)胚層細(xì)胞分化，尤其是早期胰芽細(xì)胞的形成[14]。印跡基因IGF2的表達(dá)產(chǎn)物胰島素樣生長(zhǎng)因子是一種胚胎生長(zhǎng)因子，也是一種促有絲分裂肽，生理?xiàng)l件下對(duì)胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，病理?xiàng)l件下能刺激腫瘤細(xì)胞的增殖。在嚙齒動(dòng)物中，IGF2的表達(dá)在出生后迅速下降，相當(dāng)于功能上的單倍體，即正常胎兒中只產(chǎn)生一個(gè)劑量的蛋白質(zhì)；如果2個(gè)等位基因均不表達(dá)，將表現(xiàn)為生長(zhǎng)受限；相反，如果2個(gè)等位基因均出現(xiàn)表達(dá)，必將產(chǎn)生2個(gè)劑量的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致胎兒過(guò)度生長(zhǎng)，出生體質(zhì)量過(guò)重或產(chǎn)后生長(zhǎng)速度過(guò)快[15]。本研究的雜交ES細(xì)胞系，在IGF2等位基因中存在特異性的限制性?xún)?nèi)切酶多態(tài)位點(diǎn)。母源性表達(dá)的IGF2等位基因其RT-PCR產(chǎn)物可被酶解為321 bp及59 bp片段，父源性表達(dá)的IGF2等位基因則不被酶解。據(jù)此，酶解產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳即可區(qū)分出IGF2等位基因的表達(dá)情況。研究表明，IGF2印跡丟失與多種疾病有關(guān)[16]。

筆者利用不同小鼠品系間等位基因限制性?xún)?nèi)切酶多態(tài)性，對(duì)雜交而來(lái)的SF1-G細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞，收集分化前后細(xì)胞，通過(guò)PCR-RFLP檢測(cè)印跡基因IGF2表達(dá)親本來(lái)源，結(jié)果顯示，本來(lái)主要從父源單等位基因表達(dá)的印跡基因呈雙等位基因表達(dá)，表現(xiàn)為印跡丟失狀態(tài)（LOT），其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示，在體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞時(shí)，要盡量保持其微環(huán)境的穩(wěn)定，避免引起表觀(guān)遺傳調(diào)控的異常，同時(shí)在應(yīng)用胚胎干細(xì)胞資源時(shí)要監(jiān)測(cè)其表觀(guān)遺傳的穩(wěn)定性。

Figure 2 Immun of luorescence assay for detection of specific proteins in differentiated cells（×800）圖2 分化細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)特異蛋白結(jié)果（×800）

[1]Rossant J.Stem cells from the Mammalian blastocyst[J].Stem Cells,2001,19(6):477-482.

[2]Pal R.Embryonic stem(ES)cell-derived cardiomyocytes:a good candidate for cell therapy applications[J].Cell Biol Int,2009,33(3):325-336.

[3]Hipp J,Atala A.Sources of stem cells for regenerative medicine[J].Stem Cell Rev,2008,4(1):3-11.

[4]Sun B,Ito M,Mendjan S,et al.Status of genomic imprinting in epi?genetically distinct pluripotent stem cells[J].Stem Cells,2012,30(2):161-168.

[5]Nguyen HT,Geens M,Spits C.Genetic and epigenetic instability in human pluripotent stem cells[J].Hum Reprod Update,2013,19(2):187-205.

[6]Li T,Vu TH,Ulaner GA,et al.IVF results in de novo DNA methyla?tion and histone metylation at an Igf2-H19 imprinting epigenetic switch[J].Mole Hum Repro,2005,11(9):631-640.

[7]Shi Y,Hou L,Tang F,et al.Inducing embryonic stem cells to differ?entiate into pancreatic βcells by a novel three-step approach with activin A and All-Trans retinoic acid[J].Stem Cells,2005,23(5):656-662.

[8]Turan N,Katari S,Gerson LF,et al.Inter-and intra-individualvari?ation in allele-specific DNA methylation and gene expression in?children conceived using assisted reproductive technology[J].PLoS Genet,2010,6(7):1-14.

[9]Haycock PC,Ramsay M.Exposure of mouse embryos to ethanol dur?ing preimplantation development:effect on DNA methylation inthe H19 imprinting control region[J].Biol Reprod,2009,81(4):618-627.

[10]Ueno S,Kario K.Transient complete inhibition of TGF-beta/activin/nodal signaling enhances cardiogenesis induced by canonical Wnt signaling in ES cells[C].England:Oxford Univ Press,2012.

[11]D’Amour KA,Agulnick AD,Eliazer S,et al.Efficient differentia?tion of human embryonic stem cells to definitive endoderm[J].Nat Biotechnol,2005,23(12):1534–1541.

[12]Goodman T,Crandall JE,Nanescu SE,et al.Patterning of retinoic ac?id signaling and cell proliferation in the hippocampus[J].Hippocam?pus,2012,22(11):2171-2183.

[13]Jagtap S,Meganathan K,Wagh V,et al.Embryo toxicity of alltrans-retinoic acid in human embryonic stem cells[J].Toxicology Letters,2012,211:S74-S75.

[14]Lefebvre P,Martin PJ,Flajollet S,et al.Transcriptional activities of retinoic acid receptors[J].Vitam Horm,2005,70:199-264.

[15]楊曉煜，黃燕芳.傳代培養(yǎng)對(duì)供核細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2008,46(36):1-3.

[16]Ratajczak MZ.Igf2-H19,an imprinted tandem gene,is an important regulator of embryonic development,a guardian of proliferation of adult pluripotent stem cells,a regulator of longevity,and a'pass?key'to cancerogenesis[J].Folia Histochem Cytobiol,2012,50(2):171-179.