袁 敏 劉 斌 唐 靜 李世英
自噬(autophagy)是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程,是真核細胞特有的生命現(xiàn)象[1],它是細胞生長發(fā)育、分化成熟及死亡的重要調(diào)控機制[2],與帕金森病[3]、阿爾茨海默病[4]和腦血管病[5]等多種疾病有關(guān)。Beclin-1為自噬相關(guān)基因,參與自噬體的形成,目前已作為自噬的標志分子用于檢測自噬活性[6]。細胞凋亡與血管性癡呆(vascular dementia,VD)的發(fā)病過程關(guān)系密切[7],但自噬和凋亡在VD發(fā)病過程中共同作用的研究較少。本研究旨在觀察自噬相關(guān)蛋白Beclin-1與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2在VD大鼠海馬CA1區(qū)的表達及變化情況,探討其在VD發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。
1.1 材料 (1)實驗動物。清潔級健康雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量250~280 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,合格證號SCXK(京)2010-0013。在河北聯(lián)合大學屏障環(huán)境動物實驗室自由進食喂養(yǎng),室溫控制在(23±2)℃,自然光照,實驗前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。(2)主要試劑和儀器。兔抗鼠Be?clin-1多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒購自北京博奧森公司,DAB顯色試劑盒、TUNEL檢測試劑盒均購自北京中杉金橋公司。Morris水迷宮購自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司,電凝儀器購自張家港市航天醫(yī)療電器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 動物分組 大鼠隨機分為假手術(shù)組和VD模型組,每組又隨機分為模型制備成功后1、2、4、8、12周5個亞組(各6只)。
1.2.2 VD模型制備 采用改良Pulsinelli四血管阻斷(4-VO)法制作VD模型[8]。大鼠于術(shù)前禁食12 h,用10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉后,背側(cè)頸正中切口,暴露雙側(cè)第一頸椎橫突小孔,用直徑0.5 mm電凝針插入雙側(cè)翼小孔燒灼雙側(cè)椎動脈,造成永久性閉塞。再將大鼠仰臥固定,同時行腹側(cè)頸正中切口,分離雙側(cè)頸總動脈,以4號絲線穿線備用。24 h后用微動脈夾夾閉雙側(cè)動脈5 min,共夾閉3次,每次間隔1 h。術(shù)后手術(shù)部位施以慶大霉素噴灑處理以抗感染,然后縫合,常規(guī)飼養(yǎng)觀察。假手術(shù)組步驟同上,但不做缺血處理。術(shù)后連續(xù)3 d給予慶大霉素,預防感染。
1.2.3 學習記憶能力測試 在相應(yīng)時間點前5 d,分別對各組大鼠采用Morris水迷宮實驗測試學習記憶能力,包括定位航行試驗和空間探索試驗[9]。
1.2.4 標本制備 各組大鼠在學習記憶能力測試結(jié)束后,立即以致死量10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉后,仰臥位固定于手術(shù)臺上,剪開胸腔,暴露心臟,從心尖插入灌注針至左心室,同時剪開右心耳,快速滴入37℃生理鹽水300 mL,無血污后改為滴入固定液4℃的多聚甲醛400 mL。待大鼠尾巴完全僵直時迅速斷頭,取出腦組織,固定于4%多聚甲醛溶液中12~24 h,進行脫水透明及石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片,厚度約3 μm,用經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片撈片,晾干后置于60℃的烤箱中烘烤備用。
1.2.5 Beclin-1和Bcl-2檢測 采用免疫組化SABC法,嚴格按照試劑說明書操作要求進行檢測。陽性標準:光鏡下觀察,Beclin-1蛋白染色呈棕黃色顆粒,位于胞漿內(nèi);Bcl-2蛋白染色呈棕黃色顆粒,位于核膜或胞漿內(nèi)。高倍鏡下觀察皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)不重疊的6個視野,進行Beclin-1、Bcl-2蛋白陽性細胞計數(shù),計算陽性細胞平均數(shù)。
1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量數(shù)據(jù)以±ss表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗,兩變量間關(guān)系分析采用Pearson相關(guān)分析法,Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 各組大鼠學習記憶行為學結(jié)果 第1、2天,各組大鼠尋找平臺的時間沒有明顯差異。從第3天起,模型組大鼠平均逃避潛伏期延長,穿越平臺次數(shù)顯著減少。
2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Beclin-1、Bcl-2蛋白表達結(jié)果 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)在不同時間點可見Beclin-1、Bcl-2蛋白陽性表達。模型組1周時可見Beclin-1、Bcl-2蛋白陽性表達,隨著時間的延長逐漸增強,4周達至高峰,8周開始下降,至12周仍較高。與假手術(shù)組比較,模型組各時間點的Beclin-1、Bcl-2蛋白陽性細胞均明顯增高,差異均有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05或Plt;0.01),見表1、2,圖1、2。
Table 1 Comparison of the positive expression of Beclin-1 in hippocampal CA1 area at different time points between two groups表1 2組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點Beclin-1陽性表達數(shù)比較(n=6,個/高倍視野,x±s)
Table 2 Comparison of the positive expression of Bcl-2 in hippocampal CA1 area at different time points between two groups表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點Bcl-2陽性表達數(shù)比較 (n=6,個/高倍視野,x±s)
2.3 VD大鼠海馬CA1區(qū)Beclin-1與Bcl-2表達的關(guān)系 VD大鼠海馬CA1區(qū)的Beclin-1與Bcl-2陽性表達數(shù)呈正相關(guān)(r=0.809,Plt;0.05)。
采用改良Pulsinelli四血管阻斷(4-VO)法制備大鼠VD模型是較理想的VD動物模型。本研究應(yīng)用Morris水迷宮實驗進行學習記憶能力測試,觀察各組大鼠的學習記憶能力,結(jié)果顯示,模型組大鼠平均逃避潛伏期時間延長,穿越平臺次數(shù)顯著減少,符合VD模型判定標準,提示造模成功。
自噬是指細胞在自噬相關(guān)基因(autophagy relat?ed gene,Atg)的調(diào)控下利用溶酶體、噬泡降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程[10],屬于Ⅱ型程序性細胞死亡,主要由溶酶體酶激活來執(zhí)行。Beclin-1是酵母At96/Vps30基因的同源物,Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)可與Beclin-1形成復合物參與自噬體的形成。因此,Beclin-1是自噬的重要調(diào)節(jié)因子,其表達反映了自噬的活性[6]。本研究顯示VD大鼠海馬CA1區(qū)1周時Beclin-1表達升高,4周達到高峰,8周開始下降,至12周仍較高,模型組各時間點的Beclin-1表達均高于假手術(shù)組,說明在大鼠海馬CA1區(qū)自噬明顯增強,細胞自噬可能參與了VD的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。
細胞凋亡是一種不同于壞死及自噬性死亡的細胞生理性死亡方式。細胞凋亡是由基因控制的細胞主動死亡過程,Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11],Bcl-2的高表達可阻止多種凋亡因子所致的細胞死亡,延長細胞壽命。在本實驗中,VD大鼠海馬CA1區(qū)1周時Bcl-2表達升高,4周達到高峰,8周開始下降,至12周仍較高。與假手術(shù)組比較,模型組各時間點的Bcl-2表達均明顯增高,說明在VD大鼠海馬CA1區(qū)存在細胞凋亡,細胞凋亡參與了VD的發(fā)病過程。
自噬是繼壞死和凋亡后發(fā)現(xiàn)的第3種細胞死亡形式,與疾病的發(fā)生息息相關(guān),是目前細胞領(lǐng)域研究的熱點之一。自噬、凋亡和壞死3種現(xiàn)象在細胞應(yīng)激狀態(tài)下的發(fā)生順序一直是國內(nèi)外爭論的熱點。有研究者認為當細胞遭遇應(yīng)激時,自噬最先被激活,當自噬不能維持細胞穩(wěn)態(tài)后,細胞再繼發(fā)凋亡,最后進入壞死[12]。也有研究者認為,自噬與凋亡重疊發(fā)生,平行執(zhí)行功能,互為補充,共同維持細胞穩(wěn)態(tài),抵御應(yīng)激損傷[13]。本研究顯示,VD大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達數(shù)與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達數(shù)呈正相關(guān),表明血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)細胞自噬和凋亡同時發(fā)生,且表達趨勢一致。
自噬與凋亡作為程序性細胞死亡的2種不同形式,二者之間可能存在復雜聯(lián)系,對二者的深入研究,有助于揭示血管性癡呆發(fā)生發(fā)展過程的內(nèi)在機制,為血管性癡呆的治療提供新的理論依據(jù)。
Figure 1 The expression of Beclin-1 in hippocampal CA1 area of rats at different time points between two group(immunohistochemistry,×200)圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點Beclin-1表達(免疫組化,×200)
Figure 2 The expression of Bcl-2 in hippocampal CA1 area at different time points between two group(immunohistochemistry,×200)圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點Bcl-2表達(免疫組化,×200)
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