Beclin-1與Bcl-2在血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)的表達及意義*

袁 敏 劉 斌 唐 靜 李世英

自噬(autophagy)是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細胞特有的生命現(xiàn)象[1]，它是細胞生長發(fā)育、分化成熟及死亡的重要調(diào)控機制[2]，與帕金森病[3]、阿爾茨海默病[4]和腦血管病[5]等多種疾病有關(guān)。Beclin-1為自噬相關(guān)基因，參與自噬體的形成，目前已作為自噬的標志分子用于檢測自噬活性[6]。細胞凋亡與血管性癡呆（vascular dementia,VD）的發(fā)病過程關(guān)系密切[7]，但自噬和凋亡在VD發(fā)病過程中共同作用的研究較少。本研究旨在觀察自噬相關(guān)蛋白Beclin-1與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2在VD大鼠海馬CA1區(qū)的表達及變化情況，探討其在VD發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。清潔級健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～280 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號SCXK(京)2010-0013。在河北聯(lián)合大學屏障環(huán)境動物實驗室自由進食喂養(yǎng)，室溫控制在（23±2）℃，自然光照，實驗前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。（2）主要試劑和儀器。兔抗鼠Be?clin-1多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒購自北京博奧森公司，DAB顯色試劑盒、TUNEL檢測試劑盒均購自北京中杉金橋公司。Morris水迷宮購自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，電凝儀器購自張家港市航天醫(yī)療電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠隨機分為假手術(shù)組和VD模型組，每組又隨機分為模型制備成功后1、2、4、8、12周5個亞組（各6只）。

1.2.2 VD模型制備 采用改良Pulsinelli四血管阻斷(4-VO)法制作VD模型[8]。大鼠于術(shù)前禁食12 h，用10%的水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉后，背側(cè)頸正中切口，暴露雙側(cè)第一頸椎橫突小孔，用直徑0.5 mm電凝針插入雙側(cè)翼小孔燒灼雙側(cè)椎動脈，造成永久性閉塞。再將大鼠仰臥固定，同時行腹側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，以4號絲線穿線備用。24 h后用微動脈夾夾閉雙側(cè)動脈5 min，共夾閉3次，每次間隔1 h。術(shù)后手術(shù)部位施以慶大霉素噴灑處理以抗感染，然后縫合，常規(guī)飼養(yǎng)觀察。假手術(shù)組步驟同上，但不做缺血處理。術(shù)后連續(xù)3 d給予慶大霉素，預防感染。

1.2.3 學習記憶能力測試 在相應(yīng)時間點前5 d，分別對各組大鼠采用Morris水迷宮實驗測試學習記憶能力，包括定位航行試驗和空間探索試驗[9]。

1.2.4 標本制備 各組大鼠在學習記憶能力測試結(jié)束后，立即以致死量10%的水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，同時剪開右心耳，快速滴入37℃生理鹽水300 mL，無血污后改為滴入固定液4℃的多聚甲醛400 mL。待大鼠尾巴完全僵直時迅速斷頭，取出腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中12～24 h，進行脫水透明及石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片，厚度約3 μm，用經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片撈片，晾干后置于60℃的烤箱中烘烤備用。

1.2.5 Beclin-1和Bcl-2檢測 采用免疫組化SABC法，嚴格按照試劑說明書操作要求進行檢測。陽性標準：光鏡下觀察，Beclin-1蛋白染色呈棕黃色顆粒，位于胞漿內(nèi)；Bcl-2蛋白染色呈棕黃色顆粒，位于核膜或胞漿內(nèi)。高倍鏡下觀察皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)不重疊的6個視野，進行Beclin-1、Bcl-2蛋白陽性細胞計數(shù)，計算陽性細胞平均數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以±ss表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，兩變量間關(guān)系分析采用Pearson相關(guān)分析法，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學習記憶行為學結(jié)果 第1、2天，各組大鼠尋找平臺的時間沒有明顯差異。從第3天起，模型組大鼠平均逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)顯著減少。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Beclin-1、Bcl-2蛋白表達結(jié)果 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)在不同時間點可見Beclin-1、Bcl-2蛋白陽性表達。模型組1周時可見Beclin-1、Bcl-2蛋白陽性表達，隨著時間的延長逐漸增強，4周達至高峰，8周開始下降，至12周仍較高。與假手術(shù)組比較，模型組各時間點的Beclin-1、Bcl-2蛋白陽性細胞均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05或Plt;0.01），見表1、2，圖1、2。

Table 1 Comparison of the positive expression of Beclin-1 in hippocampal CA1 area at different time points between two groups表1 2組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點Beclin-1陽性表達數(shù)比較（n=6，個/高倍視野，x±s）

Table 2 Comparison of the positive expression of Bcl-2 in hippocampal CA1 area at different time points between two groups表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點Bcl-2陽性表達數(shù)比較 （n=6，個/高倍視野，x±s）

2.3 VD大鼠海馬CA1區(qū)Beclin-1與Bcl-2表達的關(guān)系 VD大鼠海馬CA1區(qū)的Beclin-1與Bcl-2陽性表達數(shù)呈正相關(guān)（r=0.809，Plt;0.05）。

3 討論

采用改良Pulsinelli四血管阻斷(4-VO)法制備大鼠VD模型是較理想的VD動物模型。本研究應(yīng)用Morris水迷宮實驗進行學習記憶能力測試，觀察各組大鼠的學習記憶能力，結(jié)果顯示，模型組大鼠平均逃避潛伏期時間延長，穿越平臺次數(shù)顯著減少，符合VD模型判定標準，提示造模成功。

自噬是指細胞在自噬相關(guān)基因(autophagy relat?ed gene，Atg)的調(diào)控下利用溶酶體、噬泡降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程[10]，屬于Ⅱ型程序性細胞死亡，主要由溶酶體酶激活來執(zhí)行。Beclin-1是酵母At96/Vps30基因的同源物，Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)可與Beclin-1形成復合物參與自噬體的形成。因此，Beclin-1是自噬的重要調(diào)節(jié)因子，其表達反映了自噬的活性[6]。本研究顯示VD大鼠海馬CA1區(qū)1周時Beclin-1表達升高，4周達到高峰，8周開始下降，至12周仍較高，模型組各時間點的Beclin-1表達均高于假手術(shù)組，說明在大鼠海馬CA1區(qū)自噬明顯增強，細胞自噬可能參與了VD的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

細胞凋亡是一種不同于壞死及自噬性死亡的細胞生理性死亡方式。細胞凋亡是由基因控制的細胞主動死亡過程，Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]，Bcl-2的高表達可阻止多種凋亡因子所致的細胞死亡，延長細胞壽命。在本實驗中，VD大鼠海馬CA1區(qū)1周時Bcl-2表達升高，4周達到高峰，8周開始下降，至12周仍較高。與假手術(shù)組比較，模型組各時間點的Bcl-2表達均明顯增高，說明在VD大鼠海馬CA1區(qū)存在細胞凋亡，細胞凋亡參與了VD的發(fā)病過程。

自噬是繼壞死和凋亡后發(fā)現(xiàn)的第3種細胞死亡形式，與疾病的發(fā)生息息相關(guān)，是目前細胞領(lǐng)域研究的熱點之一。自噬、凋亡和壞死3種現(xiàn)象在細胞應(yīng)激狀態(tài)下的發(fā)生順序一直是國內(nèi)外爭論的熱點。有研究者認為當細胞遭遇應(yīng)激時，自噬最先被激活，當自噬不能維持細胞穩(wěn)態(tài)后，細胞再繼發(fā)凋亡，最后進入壞死[12]。也有研究者認為，自噬與凋亡重疊發(fā)生，平行執(zhí)行功能，互為補充，共同維持細胞穩(wěn)態(tài)，抵御應(yīng)激損傷[13]。本研究顯示，VD大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達數(shù)與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達數(shù)呈正相關(guān)，表明血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)細胞自噬和凋亡同時發(fā)生，且表達趨勢一致。

自噬與凋亡作為程序性細胞死亡的2種不同形式，二者之間可能存在復雜聯(lián)系，對二者的深入研究，有助于揭示血管性癡呆發(fā)生發(fā)展過程的內(nèi)在機制，為血管性癡呆的治療提供新的理論依據(jù)。

Figure 1 The expression of Beclin-1 in hippocampal CA1 area of rats at different time points between two group（immunohistochemistry，×200）圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點Beclin-1表達（免疫組化，×200）

Figure 2 The expression of Bcl-2 in hippocampal CA1 area at different time points between two group（immunohistochemistry，×200）圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點Bcl-2表達（免疫組化，×200）

[1]Yorimitsu T,Klionsky DJ.Autophagy:molecular machinery for selfeating[J].Cell Death Differ,2005,12(Suppl2):1542-1552.

[2]Mizushima N,Levine B,Cuervo AM,et al.Autophagy fights disease throughcellularself-digestion[J].Nature,2008,451(7182):1069-1075.

[3]Lynch-Day MA,Mao K,Wang K,et al.The Role of Autophagy in Par?kinson’sDisease[J].ColdSpringHarbPerspectMed,2012,2(4):a009357.

[4]Tung YT,Wang BJ,Hu MK,et al.Autophagy:a double-edged sword in Alzheimer’s disease[J].J Biosci,2012,37(1):157-165.

[5]左全庭,吳成翰,高麗麗.自噬與卒中[J].國際腦血管病雜志，2010,18(7):548-552.

[6]Rubinsztein DC.Autophagy and its possible roles in nervous system diseases damage and repair[J].Autophagy,2005,1(1):11-22.

[7]劉斌,馬原源,毛文靜,等.參芎化瘀膠囊對血管性癡呆模型大鼠海馬CA區(qū)細胞凋亡及Bcl2，Bax蛋白表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(6):176-179.

[8]Pulsinelli WA,Brierley JB,Plum F.Temporal profile of neuronal dam?age in a model of transient forebrain ischemia[J].Ann Neurol,1982,11(5):491-498.

[9]陳羅西,郭玲玲,李亮,等.Morris圓形水迷宮的應(yīng)用及其相關(guān)檢測指標分析[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2008,8（8）:55.

[10]Shpilka T，Elazar Z.Shedding light on mammalian microautophagy[J].Dev Cell，2011,20(1):1-2.

[11]Lock RB,Murphy KM.Immunodetecing members of the Bcl-2 family of proteins[J].Methods Mol Med,2005,111(1):83-96.

[12]Edinger AL,Thompson CB.Death by design:apoptosis,necrosis and autophagy[J].Curr Opin Cell Biol,2004,16(6):663-669.

[13]陳艾,周暉,童煜,等.缺氧后胚鼠神經(jīng)元自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達[J].中風與神經(jīng)疾病雜志,2012,29(8):683-686.