谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1蛋白在肺癌中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義

陳傳萍，何群，潘忠誠(chéng)，吳廣平，趙雨杰

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.生物芯片中心，衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110001；2.附屬第一醫(yī)院病理科，沈陽(yáng)110001）

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，5年存活率約為10%～15%，已成為我國(guó)惡性腫瘤死亡原因的第一位［1］。目前對(duì)肺癌尚缺乏有效的早期診斷和治療手段，深入研究與肺癌發(fā)病機(jī)制相關(guān)的因子對(duì)提高肺癌的診斷率、早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、監(jiān)測(cè)療效以及判斷預(yù)后具有重要的意義。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）家族的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)，GSTP1在喉癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌、前列腺癌及卵巢癌等多種腫瘤組織中表達(dá)異常［2～11］，提示它與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。GSTP1是肺臟重要的解毒酶，它在肺癌中的表達(dá)情況尚不清楚。本研究擬應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)檢測(cè)GSTP1在肺癌組織中的表達(dá)，旨在探討其臨床病理學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2006年1月至2011年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院具有完整臨床資料的原發(fā)性肺腺癌手術(shù)切除標(biāo)本50例，其中35例有完整隨訪資料。癌旁正常肺組織20例，肺轉(zhuǎn)移性腺癌11例，肺鱗癌14例。此外有8例肺腺癌、鱗癌及癌旁正常組織，取樣后立即置液氮中冷凍保存。

GSTP1羊抗鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司（sc-66000）；SP法免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色液購(gòu)自福州邁新公司；蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、上樣緩沖液、BCA定量及ECL發(fā)光試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)SP法：標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。3%過(guò)氧化氫室溫15 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化酶。PBS清洗后，置于檸檬酸緩沖液（pH6.0）121℃高壓熱抗原修復(fù)1 min，至自然冷卻，PBS清洗。滴加山羊血清，室溫封閉20 min。滴加一抗GSTP1（1︰500），4℃孵育過(guò)夜。次日室溫放置30 min后，PBS清洗，滴加鼠二抗，37℃10 min。PBS清洗，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶，37℃10 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化后常規(guī)脫水，透明，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。參照文獻(xiàn)［12］評(píng)分方法制定染色判斷標(biāo)準(zhǔn)。每張切片400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算5個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)，分為4級(jí)：1%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分；染色強(qiáng)度：無(wú)著色0分，淺黃色1分，黃或深黃色2分，褐或棕褐色3分。上述2項(xiàng)相乘為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：≥4分定義為高表達(dá)。

1.2.2 Western blot：稱取50 mg冷凍保存的癌及癌旁正常組織，加入300 μL裂解液和4 μL蛋白酶抑制劑，冰上超聲裂解組織5 s，重復(fù)4次。靜置30 min后，12000 r/min 4℃離心10 min，收集上清-70℃保存。測(cè)定蛋白濃度，樣品均定量為5 μg/μL，每泳道上樣50 μg蛋白，SDS-PAGE 電泳，60 V 70 min電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（GSTP11︰500，GAPDH1︰1000）。4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，1︰5000羊抗鼠二抗室溫孵育1.5 h，TBST清洗，ECL發(fā)光并以凝膠顯像儀（MF-chemibis3.2 DNR，以色列）顯像。運(yùn)用quantity one軟件，根據(jù)ECL發(fā)光成像后條帶和電泳條帶的面積和密度計(jì)算每個(gè)條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化檢測(cè)癌與癌旁組織蛋白表達(dá)差異及GSTP1蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。Western blot檢測(cè)GSTP1蛋白表達(dá)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Kaplan-Meier計(jì)算累積生存率，Log-rank進(jìn)行生存時(shí)間差異檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSTP1蛋白在肺癌組織中的表達(dá)

GSTP1在肺癌中呈胞核及胞質(zhì)表達(dá)，在50例原發(fā)性肺腺癌及14例肺鱗癌組織中分別有32及9例呈高表達(dá)，明顯高于癌旁正常組織表達(dá)水平（χ2=6.665，P=0.010；χ2=3.927，P=0.048）（圖1，表1）。但GSTP1在原發(fā)性肺腺癌、肺鱗癌及肺轉(zhuǎn)移性腺癌中的表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）（表1）。

2.2 GSTP1蛋白表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示：GSTP1蛋白表達(dá)與肺癌患者年齡、性別、腫瘤大小、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）（表1）。

2.3 GSTP1蛋白表達(dá)與肺腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系

GSTP1高表達(dá)肺腺癌患者術(shù)后中位生存時(shí)間（37個(gè)月）明顯低于GSTP1低表達(dá)患者（47個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.171，P=0.041）（圖2）。

2.4 Western blot結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示：肺癌旁組織 GSTP1/GAPDH灰度比為0.249±0.057，腺癌組織為0.370±0.089，鱗癌組織為0.337±0.084。與癌旁組織相比，GSTP1在肺腺癌與鱗癌中表達(dá)明顯上調(diào)（t=2.545，P=0.023；t=2.337，P=0.035）（圖3）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，卵巢正常組織、良性病變及癌變組織中，GSTP1表達(dá)陽(yáng)性率逐漸上升；腫瘤分化程度越低、臨床分期越晚其表達(dá)越強(qiáng)［11］；乳腺良性病變、乳腺癌組織中GSTP1表達(dá)水平明顯高于乳腺正常組織［5］；唾液腺腺樣囊性癌中GSTP1的表達(dá)也明顯高于癌旁腺體［13］。但在結(jié)腸癌及前列腺癌中，GSTP1低表達(dá)或缺失能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［8，10］。此外，GSTP1可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)能力，使細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性。提示GSTP1與腫瘤中發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥密切相關(guān)［14］。本研究通過(guò)免疫組化和Western blot證實(shí)，GSTP1在肺腺癌及鱗癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。雖然目前未見(jiàn)有關(guān)GSTP1在原發(fā)性肺腺癌、鱗癌及正常組織中表達(dá)差異的報(bào)道，但在非小細(xì)胞肺癌中已證實(shí)，GSTP1在腫瘤中表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織［3，4］。提示GSTP1在癌變組織內(nèi)的高表達(dá)可能是一種誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果，即其在腫瘤惡性轉(zhuǎn)變過(guò)程中被誘導(dǎo)激活而獲得較高的表達(dá)量，GSTP1基因的轉(zhuǎn)錄激活是化學(xué)致癌早期或啟動(dòng)階段的重要分子事件，很可能是一個(gè)啟動(dòng)信號(hào)或標(biāo)志［15］。但GSTP1在不同病理類型及不同組織來(lái)源的肺癌中表達(dá)無(wú)明顯差異，這與韓志剛等［16］報(bào)道另一個(gè)GST家族成員GST-π在非小細(xì)胞肺癌、肺鱗癌及腺癌中表達(dá)的結(jié)果一致。提示GSTP1不能作為判斷肺癌病理類型及癌組織來(lái)源的一個(gè)可靠指標(biāo)。

GSTP1在肺癌中表達(dá)上調(diào)，但與肺腺癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)均未見(jiàn)明顯相關(guān)性。在非小細(xì)胞肺癌、食管癌及胃癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)GSTP1表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性［3，17，18］，提示單純檢測(cè)GSTP1表達(dá)不能作為判斷腫瘤侵襲等生物學(xué)行為的預(yù)測(cè)指標(biāo)。此外，有限的樣本量很難真實(shí)反映結(jié)果的客觀性，后期我們將通過(guò)增加樣本量并完善病歷資料，進(jìn)一步明確GSTP1與肺癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，GSTP1高表達(dá)肺腺癌患者較低表達(dá)患者預(yù)后不良。胃癌中同樣發(fā)現(xiàn)GSTP1高表達(dá)組無(wú)復(fù)發(fā)生存率和總生存率均顯著低于低表達(dá)組［18］；食管癌中攜帶GSTP1變體Val等位基因患者較未攜帶者預(yù)后明顯不良（P=0.045）［17］。此外，卵巢癌多因素分析發(fā)現(xiàn)，GSTP1高表達(dá)患者無(wú)病生存率及總生存率明顯降低（Log-rank：P=0.047，P=0.033）［19］，提示其可以作為評(píng)估腫瘤患者預(yù)后的1個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。GSTP1可能通過(guò)以下3個(gè)方面影響腫瘤患者預(yù)后：（1）GSTP1 甲基化：Nelson 等［20］發(fā)現(xiàn)，90%以上的前列腺癌及70%前列腺上皮肉瘤發(fā)生GSTP1“CpG島”甲基化，GSTP1甲基化致功能的缺乏使正常前列腺上皮細(xì)胞易受到各種致瘤性轉(zhuǎn)化因素的攻擊；（2）GSTP1多態(tài)性與腫瘤易感性：GSTP1基因多態(tài)性在腫瘤的發(fā)生中起重要作用，可引起其表達(dá)的相應(yīng)酶的活性差異，導(dǎo)致解毒功能發(fā)生改變，從而增加個(gè)體對(duì)環(huán)境致癌物易感性及患腫瘤的危險(xiǎn)［21，22］；（3）腫瘤耐藥性：GSTP1 能催化親電子物質(zhì)與還原型谷胱甘肽結(jié)合，并可與親脂性細(xì)胞毒藥物結(jié)合增強(qiáng)其水溶性，而促進(jìn)藥物排泄，降低抗癌藥的作用。此外，GSTP1還能把抗癌藥產(chǎn)生的過(guò)氧化物還原，抑制烷化劑類化療藥物引起的癌細(xì)胞DNA交聯(lián)，最終減低藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用［14］。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，GSTP1在肺腺癌中表達(dá)上調(diào)，并與肺腺癌患者預(yù)后相關(guān)。

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