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    白藜蘆醇增加脂肪細(xì)胞3T3-L1中脂聯(lián)素表達(dá)的作用機制探討

    2013-12-03 08:09:20王添都鎮(zhèn)先張海燕鄧娓娓
    關(guān)鍵詞:胰島素

    王添,都鎮(zhèn)先,張海燕,鄧娓娓

    (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.內(nèi)分泌與代謝性疾病科;2.老年病干診科,沈陽110001)

    脂聯(lián)素,已知的有ACRP30、GBP28和Adipo Q,是在白色脂肪組織中特異性表達(dá)的一種補充因子,可提高脂肪酸氧化及胰島素敏感性[1]。最近研究證實脂聯(lián)素在調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝中起著重要的作用[2,3]。一些研究證實脂聯(lián)素和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α) 在脂肪細(xì)胞中表達(dá)呈負(fù)相關(guān),對胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用相反[1,4,5]。因此,準(zhǔn)確理解這些脂肪因子的關(guān)系及其調(diào)節(jié)機制將有助于提高胰島素相關(guān)代謝性綜合征的治療水平。已有報道白藜蘆醇能夠拮抗TNF-α抑制脂聯(lián)素的生成[6],但是這種拮抗機制仍不清楚,本研究采用白藜蘆醇、TNF-α單獨或者聯(lián)合作用脂肪細(xì)胞3T3-L1,檢測脂聯(lián)素mRNA表達(dá)及釋放、PPAR-γmRNA表達(dá)及活性,為白藜蘆醇防治2型糖尿病及代謝綜合征提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 研究試劑

    重組TNF-α購于美國Biosource公司。白藜蘆醇、異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine,IBMX)、地塞米松和胰島素購于美國Sigma公司。3T3-L1前脂肪細(xì)胞購于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。

    1.2 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)和分化

    細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM(美國Invit-rogen公司)中培養(yǎng),以濃度為1×106/孔在6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3 d。在DMEM中加入IBMX(0.5 mmol/L)、地塞米松(5 μmol/L)和胰島素(10 mg/L)誘導(dǎo)分化,誘導(dǎo)2 d后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液。在含有10%胎牛血清和10 mg/L胰島素的DMEM中再誘導(dǎo)2 d后,用含有10%胎牛血清的DMEM每2 d更換培養(yǎng)液。在誘導(dǎo)分化的12~14 d,細(xì)胞用于后續(xù)實驗。用原位油紅O染色確定細(xì)胞的分化情況,具體操作按照油紅O染色試劑盒說明書進行。超過95%的3T3-L1細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型時可進行后續(xù)實驗。

    1.3 干預(yù)實驗及分組

    (1)用白藜蘆醇(0,5,10,20,50 μmol/L)培養(yǎng)分化3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h后,用實時定量PCR法檢測白藜蘆醇對過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPAR-γ)和脂聯(lián)素基因表達(dá)的影響;(2) 用 TNF-α(0,1.0,2.5,5.0,10.0,20.0 μg/L)培養(yǎng)分化3T3-L1 脂肪細(xì)胞24 h,用實時定量PCR法檢測各組TNF-α對脂聯(lián)素基因的表達(dá);(3)在細(xì)胞分化 6~8 d,用白藜蘆醇(0,5,10,20,50 μmol/L)孵育3T3-L1 脂肪細(xì)胞 8 h。然后用或不用 TNF-α(10 ng/mL)孵育24 h,實時定量 PCR 法檢測各組脂聯(lián)素基因的表達(dá);(4)設(shè)立空白對照組、TNF-α組和白藜蘆醇+TNF-α組。在分化6~8 d時,用白藜蘆醇(20 μmol/L)或培養(yǎng)液孵育3T3-L1脂肪細(xì)胞 8 h,然后用 TNF-α(10 μg/L)或培養(yǎng)液孵育24 h,收集各組細(xì)胞,用實時定量PCR法檢測PPAR-γ基因表達(dá)。

    1.4 實時定量PCR法

    收集各組3T3-L1脂肪細(xì)胞,參照說明書,采用異硫氰酸肌法提取總RNA,用12~18的oligo(dT)和super scriptⅡ進行逆轉(zhuǎn)錄,用雙標(biāo)記熒光探針混合物在ABI prism7500自動序列分析系統(tǒng)中進行實時定量PCR分析,每組重復(fù)3次。PPAR-γ基因引物特異序列為上游5′-ATGGGTGAAACTCTGGGA-3′和下游5′-TCGGCACTCAATGGCCAT-3′。脂聯(lián)素基因引物特異序列為上游5′-TTGGTCCTAAGGGAG ACATC-3′和下游5′-CAGTGGAGCCATCATAGTGG-3′。β-actin作為內(nèi)參照,其引物特異序列為上游5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′和下游5′-GGAT CTTCATGAGGTAGTCAG-3′。PCR反應(yīng)條件為變性95℃15 s,退火 60℃ 4 min,延伸 60℃ 4 min,30個循環(huán)。兩種基因擴增結(jié)果用β-actin進行標(biāo)化。

    1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

    檢測干預(yù)實驗(1)、(2)、(3)中脂聯(lián)素釋放。收集各組3T3-L1脂肪細(xì)胞的條件培養(yǎng)液。依據(jù)小鼠脂聯(lián)素ELISA試劑盒說明書分析脂聯(lián)素的濃度。每個濃度用標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)化,并用相對未處理組百分?jǐn)?shù)來表示。

    1.6 提取細(xì)胞核并測定PPAR-γDNA結(jié)合活性

    將干預(yù)實驗⑷各組3T3-L1細(xì)胞顆粒懸于A緩沖液中(10 mmol/L Hepes,pH 7.9,1.5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L KCl和蛋白酶抑制劑的混合物)。測定PPAR-γ的活性,按照PPAR-γ轉(zhuǎn)錄因子測定試劑盒的說明書進行操作。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.5軟件處理,所有實驗均重復(fù)3次,結(jié)果以±s表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和 post hoc Dunnett′s test,以 P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 白藜蘆醇對PPAR-γ在3T3-L1脂肪細(xì)胞中表達(dá)的影響

    3T3-L1細(xì)胞系由成纖維細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞,分化10~12 d后>95%的細(xì)胞呈現(xiàn)出顯著的多囊泡脂質(zhì)沉積(圖1)。脂肪分化的重要標(biāo)志(成熟的脂肪細(xì)胞)是轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ,在成纖維細(xì)胞(0 d)中沒有轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),但是在分化步驟中開始增加[前脂肪細(xì)胞(2 d)、不成熟或者年輕的脂肪細(xì)胞(4~8 d)、成熟的脂肪細(xì)胞(12 d)]。白藜蘆醇增加PPAR-γ表達(dá)呈劑量依賴方式,與對照組比較,50 μmol/L白藜蘆醇處理組中PPAR-γmRNA水平增加近2倍(表1)。

    2.2 白藜蘆醇對脂聯(lián)素在分化3T3-L1脂肪細(xì)胞中表達(dá)及分泌的影響

    為探討白藜蘆醇對脂聯(lián)素表達(dá)及分泌的作用,用不同濃度白藜蘆醇處理完全分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h。與對照組比較,白藜蘆醇在濃度為10~50 μmol/L時,脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)呈劑量依賴方式增加(P<0.05);與此相平行,脂聯(lián)素的分泌釋放也呈現(xiàn)劑量依賴方式增加(表1)。

    2.3 TNF-α對脂聯(lián)素在分化3T3-L1脂肪細(xì)胞中表達(dá)及釋放的影響

    為了證實TNF-α對脂聯(lián)素mRNA表達(dá)及分泌的作用,不同濃度的重組鼠TNF-α作用于完全分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h。與對照組比較,從濃度2.5 ng/mL開始,脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平成劑量依賴效應(yīng)增加(P<0.01)。與mRNA表達(dá)相平行,ELISA檢測結(jié)果顯示:TNF-α組中脂聯(lián)素分泌的減少也呈現(xiàn)劑量依賴方式(表2)。

    2.4 白藜蘆醇對TNF-α抑制的脂聯(lián)素表達(dá)及分泌的影響

    白藜蘆醇顯著拮抗TNF-α誘導(dǎo)的脂聯(lián)素分泌減低,與TNF-α組比較,白藜蘆醇+TNF-α組在白藜蘆醇濃度為20 μmol/L及50 μmol/L時脂聯(lián)素分泌顯著增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與脂聯(lián)素的分泌模式相平行,在mRNA水平上,白藜蘆醇部分拮抗TNF-α介導(dǎo)的脂聯(lián)素表達(dá)抑制,見表3。這個結(jié)果提示白藜蘆醇對脂聯(lián)素分泌的作用源于脂聯(lián)素表達(dá)的調(diào)節(jié)。另外,盡管白藜蘆醇的拮抗作用呈劑量依賴方式,但是最大的抑制效應(yīng)也是部分的。

    2.5 白藜蘆醇對TNF-α誘導(dǎo)PPAR-γmRNA表達(dá)及活性抑制的影響

    為了明確白藜蘆醇的調(diào)節(jié)作用是否通過PPAR-γ介導(dǎo),我們測定3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞核提取物中PPAR-γDNA結(jié)合活性。結(jié)果顯示:TNF-α顯著抑制PPAR-γ活性,白藜蘆醇拮抗TNF-α抑制PPAR-γ DNA的結(jié)合活性(P<0.01)。用實時定量PCR法檢測白藜蘆醇對PPAR-γmRNA表達(dá)的作用,得到相似的結(jié)果,白藜蘆醇拮抗TNF-α介導(dǎo)的PPAR-γ mRNA抑制(P<0.01),見表4。

    3 討論

    胰島素抵抗與代謝綜合征(包括2型糖尿病和肥胖)密切相關(guān)。胰島素抵抗的患者及動物模型中,脂聯(lián)素血漿濃度和mRNA表達(dá)是下降的[7]。脂聯(lián)素生成調(diào)控的分子機制尚不十分明確。有報道證實,脂肪細(xì)胞中影響胰島素敏感性的一些激素和細(xì)胞因子對脂聯(lián)素表達(dá)和分泌有正面或者負(fù)面的影響。例如,噻唑烷二酮是PPAR-γ激動劑,可以增加脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素基因的表達(dá)以及循環(huán)中脂聯(lián)素的水平[8]。相反,另外一種可以誘導(dǎo)胰島素抵抗的細(xì)胞因子——TNF-α,作為脂聯(lián)素主要的負(fù)性調(diào)節(jié)劑導(dǎo)致代謝紊亂[9]。脂聯(lián)素和TNF-α在脂肪細(xì)胞中呈負(fù)相關(guān)表達(dá),在胰島素抵抗的調(diào)節(jié)上起著相反的作用[1,4,5]。由于脂聯(lián)素對胰島素相關(guān)的代謝性疾病的保護性作用,TNF-α誘導(dǎo)脂聯(lián)素表達(dá)減少可能是胰島素抵抗進展的主要事件。

    白藜蘆醇是一種自然存在的多酚,在紅酒、藍(lán)莓和花生中的含量較高。盡管已有報道證實白藜蘆醇有許多有益的作用,但對于脂聯(lián)素的調(diào)節(jié)機制尚不明確。本研究證實白藜蘆醇增加脂聯(lián)素在分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞中的表達(dá)及分泌;這與陳思凡等[10]報道的無論胰島素存在與否,白藜蘆醇都可使胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)增加,提示白藜蘆醇可能通過增加脂聯(lián)素的表達(dá)水平來改善胰島素抵抗相一致。但也有報道[11]證實白藜蘆醇抑制脂連素mRNA的表達(dá),在抑制脂肪細(xì)胞分化方面,添加不同劑量的白藜蘆醇可明顯抑制細(xì)胞的分化,減少脂肪的蓄積。導(dǎo)致兩種不同結(jié)論的原因可能與脂肪細(xì)胞分化程度不同有關(guān)。本研究證實白藜蘆醇增加脂聯(lián)素在分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞中表達(dá)及分泌的機制是白藜蘆醇增加PPAR-γ在3T3-L1脂肪細(xì)胞中的表達(dá);并能有效抑制TNF-α誘導(dǎo)脂聯(lián)素分泌的下降,脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)與白藜蘆醇誘導(dǎo)脂聯(lián)素的分泌呈平行變化;白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)PPAR-γ活性拮抗TNF-α誘導(dǎo)下調(diào)脂聯(lián)素分泌及mRNA表達(dá)。有文獻報道[12]在高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型中證實PPAR-γ激動劑通過調(diào)控脂肪細(xì)胞分泌的脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素的表達(dá),改善胰島素抵抗,但調(diào)節(jié)機制沒有闡明。本研究可以部分證明白藜蘆醇增加脂連素的表達(dá)是通過增加PPAR-γ活性拮抗TNF-α對脂聯(lián)素分泌及mRNA表達(dá)的抑制作用來實現(xiàn)的。

    綜上所述,本研究提示白藜蘆醇能夠通過調(diào)節(jié)PPAR-γ的轉(zhuǎn)錄活性繼而拮抗TNF-α誘導(dǎo)下調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的表達(dá)及分泌,這一結(jié)果將有助于設(shè)計新的治療藥物或治療方法,促進胰島素抵抗及2型糖尿病治療手段的發(fā)展。

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