單核細(xì)胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株的構(gòu)建

李勝軍，閻雪晶，王艦

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室；2.第95期臨床醫(yī)學(xué)七年制；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）廣泛存在于自然界中，是一種人畜共患病的病原菌，能通過污染的食品引起人、畜的李氏特菌病，易感者為新生兒、孕婦、40歲以上的成人和免疫功能缺陷者，感染后主要表現(xiàn)為食物中毒、敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多［1～3］。在LM感染過程中，LM對(duì)宿主細(xì)胞的黏附發(fā)揮關(guān)鍵性作用，這種黏附與LM的一些表面蛋白有關(guān)，如InlA、InlB、VIP、SrtA、纖維黏連蛋白結(jié)合蛋白（FbpA）等［4］。FbpA有570個(gè)氨基酸，與肺炎鏈球菌表面的黏附分子PavA、化膿性鏈球菌表面的黏附分子Fbp54具有高度的同源性，在LM黏附宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用［5］。本研究通過PCR從LM基因組中擴(kuò)增出fbpa基因全序列及其上、下游基因序列，并構(gòu)建可用于其基因敲除的質(zhì)粒，將基因敲除質(zhì)粒導(dǎo)入LM后，通過同源重組的方法構(gòu)建LM的fbpa基因敲除菌株（Δfbpa）以便進(jìn)一步研究其致病機(jī)制及fbpa基因功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基：LM1b1684標(biāo)準(zhǔn)株、大腸桿菌DH5α菌株、質(zhì)粒pCRⅡ、pAULA（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室），胰酶大豆肉湯（Tryptic Soy broth，TSB）、溶菌肉湯（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基（美國(guó)BD Biosceneces公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、KpnⅠ、SalⅠ 、 堿 性 磷 酸 酶 、DNA Marker DL1000、DNA Marker DL2000（日本TaKaRa公司），T4 DNA ligase（美國(guó)Promega公司），基因組DNA小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），細(xì)菌PCR試劑盒（美國(guó)GENERON公司），Plasmid mini kitⅠ（美國(guó) Omega公司），Western blot試劑盒（藍(lán)基生物科技）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：PTC-200型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)MJ RESEARCH公司），MUPID電泳儀（美國(guó)Advance公司），GDS-8000型全自動(dòng)凝膠成像分析儀（美國(guó)UVP公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LM、Δfbpa和大腸桿菌DH5α菌株的培養(yǎng)：LM、Δfbpa以TSB培養(yǎng)基，大腸桿菌以LB培養(yǎng)基，37℃、120 r/min培養(yǎng)。

1.2.2 LM基因組DNA的制備：收集過夜培養(yǎng)的LM，按基因組DNA小量抽提試劑盒說明書抽提基因組DNA，置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 fbpa（IMO1829）及其上下游基因（IMO1828、IMO1830）片段的克隆及擴(kuò)增：取10 ng基因組DNA為模板，采用正向、反向引物（表1）進(jìn)行全序列擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72℃55 s，72℃4 min，30個(gè)循環(huán)，72℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳后，按DNA凝膠回收試劑盒說明書回收目的基因片段?；厥掌闻c載體質(zhì)粒pCRⅡ相連，分別常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，平板培養(yǎng)并篩選出陽(yáng)性克隆，LB培養(yǎng)基37℃恒溫振蕩過夜培養(yǎng)，收集菌體，按Plasmid mini kitⅠ試劑盒說明書提取質(zhì)粒。獲得的質(zhì)粒分別命名為pCRⅡ-fbpa、pCRⅡ-IMO1828、pCRⅡ-IMO1830。分別以 KpnⅠ、BamHⅠ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切3種質(zhì)粒，經(jīng)2%瓊脂糖電泳后，回收目的基因片段，置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆茫?］。

1.2.4 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建：采用KpnⅠ、BamHⅠ雙酶切，將pAULA載體質(zhì)粒線性化，采用堿性磷酸酶進(jìn)行線性化載體質(zhì)粒尾端去磷酸化，防止自連，經(jīng)1.25%瓊脂糖電泳后，膠回收、純化載體。取前一操作制備的上游基因片段（534 kb）與線性化的pAULA載體在14℃連接過夜。連接物常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽(yáng)性克隆采用KpnⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定。獲得的質(zhì)粒命名為pAULA-upstream。按照如上操作，以BamHⅠ、SalⅠ雙酶切pAULA-upstream，連接下游基因片段（575 kb）與線性化的pAULA-upstream，常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得的質(zhì)粒命名為 pAULA-Δfbpa［5］。

1.2.5 基因敲除菌株的構(gòu)建：將pAULA-Δfbpa質(zhì)粒與LM放入2 mm電轉(zhuǎn)杯，在2.5 kV、5 ms條件下將pAULA-Δfbpa質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LM后實(shí)現(xiàn)同源重組，LBEm培養(yǎng)篩選出溫度敏感突變株［7］。

1.2.6 蛋白質(zhì)提取與Western blot鑒定：LM、Δfbpa經(jīng)TSB培養(yǎng)基37℃振蕩過夜培養(yǎng)，收集菌體，超聲裂解細(xì)菌，15000 r/min、4℃離心15 min，取上清5 μL進(jìn)行定量，蛋白定量后取30 μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離，4℃過夜，恒壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，按Western blot試劑盒說明書進(jìn)行FbpA鑒定。

2 結(jié)果

2.1 fbpa（IMO1829）基因及其上下游基因片段的克隆及鑒定結(jié)果

將PCR擴(kuò)增的fbpa及其上下游基因（IMO1828、IMO1830）與pCRⅡ連接后，分別常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示fbpa、IMO1828、IMO1830基因片段成功克?。▓D1）。

2.2 敲除質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定結(jié)果

構(gòu)建的敲除質(zhì)粒pAULA-Δfbpa采用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定得1109 bp和未切完全的原質(zhì)粒（約9 kb）2個(gè)條帶的克隆為陽(yáng)性克?。▓D2）。

2.3 敲除菌株鑒定結(jié)果

抽提LM、Δfbpa的基因組DNA，采用fbpa基因正向、反向引物，PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示Δfbpa基因組DNA無(wú)fbpa基因片段（圖3）。LM、Δfbpa過夜培養(yǎng)后，收集并超聲裂解細(xì)菌，提取蛋白并定量后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示Δfbpa無(wú)FbpA蛋白表達(dá)（圖4）。

2.4 敲除菌株生長(zhǎng)特性鑒定結(jié)果

LM、Δfbpa過夜培養(yǎng)，以5%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的100 mL TSB培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min培養(yǎng)，分別在0、1、2、4、6、12、24 h 檢測(cè)菌體的生長(zhǎng)情況，敲除菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致（圖5）。

3 討論

LM是廣泛存在于自然界中經(jīng)由食物傳染的革蘭陽(yáng)性菌，可以引起人和動(dòng)物的各種感染癥，感染后主要表現(xiàn)為食物中毒、敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多［1～3］。LM可侵襲宿主專職及非專職吞噬細(xì)胞，侵襲過程包括侵入宿主細(xì)胞、裂解吞噬溶酶體或內(nèi)溶酶體、在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)增殖、細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播等［8～11］。

LM對(duì)宿主細(xì)胞的黏附發(fā)揮關(guān)鍵性作用，這種黏附與LM的一些表面蛋白有關(guān)，如InlA、InlB、VIP、SrtA、FbpA 等［4］。FbpA 有570個(gè)氨基酸，與肺炎鏈球菌表面的黏附分子PavA、化膿性鏈球菌表面的黏附分子Fbp54具有高度的同源性，在LM黏附宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用［5］。

在研究細(xì)菌表面黏附分子FbpA在LM感染癥發(fā)病機(jī)制中的作用時(shí)，有必要表達(dá)并提純重組FbpA蛋白及構(gòu)建fbpa基因敲除菌株。本文作者已表達(dá)并提純重組FbpA蛋白。在本研究中，我們通過PCR從LM基因組中擴(kuò)增出fbpa基因全序列及其上、下游基因序列，并構(gòu)建可用于其基因敲除的質(zhì)粒，將基因敲除質(zhì)粒導(dǎo)入LM后，通過同源重組的方法構(gòu)建LM的fbpa基因敲除菌株（Δfbpa）。本研究成果有利于進(jìn)一步研究FbpA蛋白在LM侵襲宿主細(xì)胞過程中，對(duì)LM黏附宿主細(xì)胞、LM從吞噬溶酶體或內(nèi)溶酶體逃脫、LM在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的增殖、LM在細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播的影響。

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