人源醛酮還原酶7A2融合蛋白的純化及其對(duì)苯代謝產(chǎn)物的催化活性

李丹，初陽(yáng)，劉雅茹，張歧山，秦勇

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生物制藥教研室，沈陽(yáng)110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng)110001；3.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)情報(bào)科，沈陽(yáng)1108 40）

苯是環(huán)境污染物中廣泛存在的一種致癌物質(zhì)，可引起非淋巴細(xì)胞性白血病等血液疾病，低劑量的苯還能引起白細(xì)胞及血小板減少［1］。苯的毒性大部分來(lái)源于它的代謝產(chǎn)物。苯代謝產(chǎn)物主要通過(guò)2種途徑產(chǎn)生：一種是通過(guò)對(duì)苯環(huán)的修飾，如苯甲醛和對(duì)苯醌，一種是通過(guò)開(kāi)環(huán)反應(yīng)，如反向，反向-2，4-二烯-1，6-己二酮（trans，trans-muconaldehyde，MUC）［2］。這2種代謝途徑都能產(chǎn)生具有毒性和致畸性的產(chǎn)物，能導(dǎo)致骨髓細(xì)胞形成微核，能與DNA、蛋白質(zhì)直接反應(yīng)形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞損害［3～5］。目前關(guān)于苯的代謝途徑及調(diào)控回路尚未完全清楚［6］。結(jié)合多個(gè)苯代謝產(chǎn)物具有羥基的結(jié)構(gòu)特征，本研究擬探索醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKR）在苯代謝途徑中的潛在作用。AKR是一類(lèi)針對(duì)羰基化合物的NADPH依賴(lài)型氧化還原酶，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物中［7］，能催化還原一系列自然界存在的或合成的醛酮化合物為毒性較小或無(wú)毒性的相應(yīng)的醇［8］。人源AKR7A2最早在腦中發(fā)現(xiàn)，是琥珀半醛還原酶，能還原琥珀半醛為γ-羥基丁酸甲酯［9］。后期研究發(fā)現(xiàn)，AKR7A2還分布于肝和腎等多種組織［10］，而且對(duì)多種醛或酮有催化活性，對(duì)具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)或雙羥基結(jié)構(gòu)的醛或酮也具有一定催化活性［10，11］。本研究擬使用快速蛋白液相層析（fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC）系統(tǒng)采用兩步純化法純化重組AKR7A2融合蛋白，并通過(guò)酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKR7A2重組蛋白對(duì)苯代謝產(chǎn)物的底物特異性，為進(jìn)一步探索苯及其代謝產(chǎn)物的代謝途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21購(gòu)自Novagen公司；ECL試劑盒購(gòu)自PIERCE公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自NEB公司；5 mL HiTrap親和柱購(gòu)自GE公司；NADPH、苯甲醛、對(duì)苯醌、MUC及IPTG購(gòu)自Sigma公司；AKR7A2的重組質(zhì)粒pLI19和兔抗AKR7A2多克隆抗體由英國(guó)University of Strathclyde的Elizabeth Ellis博士惠贈(zèng)［9］；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)：將質(zhì)粒pLI19轉(zhuǎn)化至BL21細(xì)菌感受態(tài)，涂布于含氨芐霉素和氯霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取轉(zhuǎn)化后單菌落接種到培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，將菌液按1︰50接種到500mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A600約為0.6時(shí)加入IPTG，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)約2 h。收集菌液，并取少量菌液加入1×SDS loading buffer中，100℃加熱5 min，取上清進(jìn)行100 g/L的SDS-PAGE電泳。聚丙烯凝膠考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

1.2.2 使用FPLC系統(tǒng)純化AKR7A2融合蛋白：挑取轉(zhuǎn)化后的菌落，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集菌體，加入溶解緩沖液充分重懸菌體，超聲破碎2 min，冰浴20 min；4℃，12000 r/min離心20 min后收集上清液。融合蛋白的純化使用Pharmacia公司的FPLC系統(tǒng)。將上清液稀釋到50 mL，加入HiTrap親和柱中，用50 mL Start buffer清洗，經(jīng)梯度洗脫后，收集洗脫液。將HiTrap柱的洗脫液加入到G25 Sephadex凝膠柱中，經(jīng)Desalt buffer洗脫后，收集洗脫液。從2次洗脫液中分別取10 μL純化的蛋白，加入2×SDS loading buffer，100℃加熱5 min，行SDS-PAGE電泳。聚丙烯凝膠考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察重組蛋白的純化。

1.2.3 Western blot：將純化后的蛋白經(jīng)100 g/L的SDS-PAGE凝膠分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉常溫封閉1 h，TBST洗膜15 min×4次。加入兔抗 AKR7A2抗體（1︰2000），4℃過(guò)夜，TBST洗膜15 min×4 次。加 HRP-羊抗兔 IgG（1︰10000），室溫1 h，TBST洗15 min×4次。ECL顯色曝光。

1.2.4 AKR酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKR7A2對(duì)苯代謝產(chǎn)物的底物特異性：使用Beckman公司的DU650分光光度計(jì)進(jìn)行AKR7A2的底物催化活性測(cè)定。反應(yīng)在25℃進(jìn)行，測(cè)量反應(yīng)混合液在340 nm的光吸收值，反應(yīng)混合液1mL中含100mol/L磷酸鈉溶液（pH6.8），0.05 mol/L NADPH，約10 μg純化蛋白和反應(yīng)底物。以無(wú)純化蛋白的反應(yīng)混合液做空白對(duì)照，結(jié)果表達(dá)為 nmol·min－1·mg－1。AKR7A2 的特異性底物琥珀半醛、鄰羧基苯甲醛和9，10-菲醌做陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 AKR7A2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pLI19轉(zhuǎn)化至BL21表達(dá)菌中，經(jīng)IPTG37℃誘導(dǎo)2 h，取少量菌液經(jīng)SDS-PAGE分析，可見(jiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在36 kDa處呈現(xiàn)明顯的條帶（圖1C）。誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)超聲裂解，離心，收集上清液。使用FPLC系統(tǒng)通過(guò)HiTrap親和柱（圖1A）及G25 Sephadex凝膠柱（圖1B） 對(duì) His標(biāo)簽的AKR7A2融合蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析純化后的蛋白可見(jiàn)單一的條帶（圖1C），表明重組AKR7A2蛋白被成功誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得高純度的單一蛋白。

2.2 融合蛋白的鑒定

Western blot分析純化后的蛋白，結(jié)果顯示：兩步純化后的AKR7A2融合蛋白能被兔抗AKR7A2多克隆抗體特異性識(shí)別（圖2），表明AKR7A2融合蛋白被成功純化。

2.3 AKR酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示：AKR7A2重組蛋白對(duì)苯甲醛的底物特異性為（62±5）nmol·min－1·mg－1，表現(xiàn)為中等親和力；對(duì)MUC的底物特異性為（149±8）nmol·min－1·mg－1，表現(xiàn)為較高的親和力；對(duì)對(duì)苯醌的親和力較低，底物特異性為（26±3.2）nmol·min－1·mg－1（表1）。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)人體表達(dá)的AKR共有13個(gè)，其中AKR7A亞族有2個(gè)人源成員AKR7A2和AKR7A3［7］。AKR7A2作為腦中琥珀半醛還原酶的功能已有較多研究，最新研究發(fā)現(xiàn)AKR7A2還能保護(hù)細(xì)胞免受多個(gè)有毒醛或酮的毒害，是體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一［11，12］。AKR7A2成員對(duì)具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)或雙羥基結(jié)構(gòu)的醛或酮也具有一定催化活性［10］，表明其有可能參與具有此結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的苯代謝產(chǎn)物的代謝。

本研究在BL21大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)His標(biāo)簽的AKR7A2融合蛋白，對(duì)His-AKR7A2融合蛋白的純化方法進(jìn)行優(yōu)化，采用FPLC系統(tǒng)經(jīng)HiTrap親和柱和G25 Sephadex凝膠柱體外純化His-AKR7A2蛋白。通過(guò)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot驗(yàn)證了純化后的AKR7A2重組蛋白。AKR酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)純化的AKR7A2重組蛋白對(duì)苯代謝產(chǎn)物苯甲醛、MUC和對(duì)苯醌的底物特異性，結(jié)果顯示：AKR7A2對(duì)苯甲醛有中等親和力，對(duì)MUC有較高的親和力，但對(duì)對(duì)苯醌的親和力較低。本研究結(jié)果表明，AKR對(duì)苯代謝產(chǎn)物有一定的催化活性，很可能參與苯的中間代謝產(chǎn)物的代謝，為探索苯的體內(nèi)代謝途徑提供了新思路。

［1］Wetmore BA，Struve MF，Gao P，et al.Genotoxicity of intermittent co-exposure to benzene and toluene in male CD-1 mice ［J］.Chem Biol Interact，2008，173（3）：166-178.

［2］Snyder R，Hedli CC.An overview of benzene metabolism［J］.Environ Health Perspect，1996，104（Suppl 6）：1165-1171.

［3］Latriano L，Goldstein BD，Witz G.Formation of muconaldehyde，an open-ring metabolite of benzene，in mouse liver microsomes：an additionalpathwayfortoxicmetabolites［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1986，83（21）：8356-8360.

［4］Amin RP，Witz G.DNA-protein crosslink and DNA strand break formation in HL-60 cells treated with trans，trans-muconaldehyde，hydroquinone and their mixtures［J］.Int J Toxicol，2001，20（2）：69-80.

［5］Rivedal E，Leithe E.The benzene metabolite trans，trans-muconaldehyde blocks gap junction intercellular communication by cross-linking connexin43［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2008，232（3）：463-468.

［6］Matsunaga T，Shinoda Y，Inoue Y，et al.Aldo-keto reductase1C15 as a quinone reductase in rat endothelial cell：its involvement in redox cycling of 9，10-phenanthrenequinone［J］.Free Radic Res，2011，45（7）：848-857.

［7］Barski OA，Tipparaju SM，Bhatnagar A.The aldo-keto reductase superfamily and its role in drug metabolism and detoxification［J］.Drug Metab Rev，2008，40（4）：553-624.

［8］Jin Y，Penning TM.Aldo-keto reductases and bioactivation/detoxication［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2007，47：263-292.

［9］Lyon RC，Johnston SM，Watson DG，et al.Synthesis and catabolism of gamma-hydroxybutyrate in SH-SY5Y human neuroblastoma cells：role of the aldo-keto reductase AKR7A2［J］.J Biol Chem，2007，282（36）：25986-25992.

［10］O′Connor T，Ireland LS，Harrison DJ，et al.Major differences exist in the function and tissue-specific expression of human aflatoxin B1 aldehyde reductase and the principal human aldo-keto reductase AKR1 family members［J］.Biochem J，1999，343（Pt2）：487-504.

［11］Li D，F(xiàn)errari M，Ellis EM.Human aldo-keto reductase AKR7A2 protects against the cytotoxicity and mutagenicity of reactive aldehydes and lowers intracellular reactive oxygen species in hamster V79-4 cells［J］.Chem Biol Interact，2012，195（1）：25-34.

［12］Ahmed MM，Wang T，Luo Y，et al.Aldo-keto reductase-7A protects liver cells and tissues from acetaminophen-induced oxidative stress and hepatotoxicity［J］.Hepatology，2011，54（4）：1322-1332.