灌注華蟾素對SD大鼠膀胱腫瘤抑制的實驗觀察

潘彩明，沈群山，黃后寶，蔡張愉，王 嘯，姜書傳，董昌斌

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 泌尿外科，安徽 蕪湖 241001)

關(guān)于抗癌藥物抑制膀胱腫瘤的動物研究，目前多以建立某品系大鼠的膀胱腫瘤模型，再運用藥物進行灌注，以觀察抗癌藥的抑癌效果，其中動物模型的建立以MNU誘導(dǎo)大鼠膀胱腫瘤的模型較為穩(wěn)定。華蟾素系中藥大蟾蜍皮的水制劑，有研究表明運用華蟾素對大鼠膀胱腫瘤行灌注治療，有一定的抗癌作用［1］，同時還能刺激骨髓增生，且華蟾素毒副作用較小，但與臨床常用的膀胱灌注藥物相比，其療效如何，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是否有一定的抑制作用，其相關(guān)研究較少，故本實驗主要觀察華蟾素灌注大鼠膀胱與常用預(yù)防膀胱癌的灌注藥物如卡介苗、阿霉素相比療效是否有差異;觀察華蟾素膀胱灌注對SD大鼠的膀胱腫瘤的生長是否有干預(yù)影響?，F(xiàn)將實驗內(nèi)容報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 75只SD雌性大鼠，實驗中大鼠周齡為3～15周，體質(zhì)量150～350 g，由江蘇南京青龍山動物實驗中心提供，編號為［SCXK(蘇)2007-0001］。

1.1.2 主要試劑 MNU購自美國Sigma公司，劑量為5mg/支(批號:20100525);BCG由上海生物制品研究所提供，劑量為 50mg/支(批號:200707001);ADM購自汕頭經(jīng)濟特區(qū)明治原藥有限公司，劑量為10mg/支(批號070901);華蟾素購于安徽金蟾生化股份有限公司。

1.2 方法 實驗動物的飼養(yǎng)分組及灌注 實驗動物飼養(yǎng)于SPF級實驗室，隨機分組，詳見表1。

表1 動物分組及灌注劑量Tab 1 Animal grouping and the dosage of perfusion

1.3 藥物灌注方法 向SD大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥液，劑量按20 mg/kg換算。用碘伏液消毒其尿道外口，選用5 cm硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道插入膀胱，先排空尿液，再使用胰島素注射器向每只大鼠膀胱內(nèi)注入相對應(yīng)藥液0.2 ml。BCG液以20 ml生理鹽水配制成 2.5 mg/ml，BCG 一次劑量 0.5 mg，約為3 mg/kg，與臨床使用的較高濃度相當(按成人體質(zhì)量50 kg計算，劑量為150 mg/次);華蟾素濃度為1 mg/ml，由前期預(yù)實驗(序貫法)得出灌注0.2 mg，即每只用量0.2 ml;ADM每次灌注劑量是0.2 mg，與臨床使用的濃度一致。

1.4 標本采集與組織病理學(xué)檢查 所有實驗大鼠均于灌注完成1周后處死，將膀胱完整切除，膀胱組織用10%甲醛液進行固定，行HE染色檢查，觀察SD大鼠的膀胱腫瘤的致瘤率及其病理分級，同時觀察腹內(nèi)臟器，并每組隨機選取10只SD大鼠的其他臟器(卵巢、肝臟、脾、腎臟等)進行組織病理學(xué)檢查。所有切片由兩名病理科醫(yī)師進行病理分級、分期檢查(參考人類UICC、TNM系統(tǒng)標準)，分組信息未提供給病理科醫(yī)師。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。各組數(shù)值采用卡方檢驗進行分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實驗過程中A組大鼠毛色、生長、飲食、活動等情況均良好，B組大鼠一般情況較差，C、D、E組大鼠生長、飲食等情況較B組大鼠稍好，均未觀察到明顯血尿和便血，A組實驗過程中死亡1只大鼠。

2.2 大體觀察 A組膀胱體積較小，壁薄，多數(shù)膀胱壁黏膜光滑，血管清晰，無潰瘍、充血、新生物等征象;少數(shù)膀胱壁黏膜充血，局部可見腫物，偶有結(jié)石樣鈣化，雙側(cè)腎臟及其他臟器未見粟粒樣結(jié)節(jié)。B組膀胱體積較大，壁厚，黏膜表面絕大多數(shù)可見腫物，大小不等，有的腫物呈菜花狀表現(xiàn)。C、D、E組膀胱壁表面可見多發(fā)的米粒狀、乳頭狀或結(jié)節(jié)狀腫物，體積較B組小。各組其他臟器和組織均未見腫瘤。

2.3 組織病理學(xué)檢查 光鏡觀察A組大鼠14只大鼠均未見異常增生，絕大多數(shù)切片上皮細胞排列整齊;B組13只大鼠發(fā)生膀胱移行細胞癌，細胞層次增多，排列紊亂，有病理核分裂相，局部區(qū)域或多個區(qū)域乳頭狀增生(圖1);C組6只大鼠發(fā)生膀胱移行細胞癌;D組7只大鼠發(fā)生膀胱移行細胞癌;E組5只大鼠發(fā)生膀胱移行細胞癌;C組、D組及E組三者病理類型相似(圖2～4)。各組之間癌變率的比較見表2(χ2=20.060，P ＜0.05)。SD 大鼠的其他臟器(卵巢、肝臟、脾、腎臟等)組織病理學(xué)檢查未見異常。

表2 各組大鼠膀胱腫瘤致瘤率的比較Tab 2 Comparison of the incidence rate of bladder cancer in rats in diffrent groups

圖1 MNU組腫瘤組織病理圖像(HE×100)Fig 1 Pathological image of tumor tissue for MNU group(HE×100)

圖2 華蟾素組腫瘤組織病理圖像(HE×100)Fig 2 Pathological image of tumor tissue for cinobufagin injection group(HE×100)

圖3 ADM組腫瘤組織病理圖像(HE×100)Fig 3 Pathological image of tumor tissue for ADM group(HE×100)

圖4 BCG組腫瘤組織病理圖像(HE×100)Fig 4 Pathological image of tumor tissue for BCG group(HE×100)

3 討論

華蟾素是我國傳統(tǒng)生物藥材中華大蟾蜍皮經(jīng)科學(xué)方法提取、加工制成的水溶性制劑，其主要有效成分為吲哚生物堿和蟾蜍毒素等。近年來，隨著對華蟾素的藥理作用和臨床應(yīng)用的深入研究，已證實了華蟾素具有抗病毒、抗腫瘤、止痛、強心、促進骨髓增生、增強機體免疫力等作用，尤其是具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞分化和促進細胞凋亡等作用［2－3］，使得華蟾素在抗腫瘤方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。

現(xiàn)代實驗研究已經(jīng)證實Cino具有一定的抗腫瘤活性且相對毒性低，用藥安全，能有效抑制DNA和 RNA 的合成，干擾細胞的代謝［4－5］。劉祥勝等［6］研究證實Cino能促進脾淋巴細胞分泌白細胞介素-2，增強了T淋巴細胞的免疫能力，從而提高其對腫瘤細胞的殺傷力。Cino還具有抑制腫瘤細胞增長和刺激免疫系統(tǒng)的作用［7］，顯示Cino是理想的抗癌生物制劑。華蟾素雖有抗腫瘤活性，但由于具有相對的毒性，特別是心肌毒性［8］;在靜脈使用時也有不良反應(yīng)，其中以血管刺激導(dǎo)致疼痛和藥物過敏反應(yīng)較為多見;少數(shù)患者還會出現(xiàn)寒戰(zhàn)、高熱、粒細胞減少等［9］。另外，臨床上使用華蟾素注射液的多為患有惡性腫瘤的老年患者，身體基礎(chǔ)情況又較差，致使許多患者長期使用華蟾素注射液靜脈內(nèi)治療難以耐受。

有研究提示，華蟾素局部運用于大鼠膀胱腫瘤的灌注治療，有一定的抗癌作用。本實驗在誘導(dǎo)SD大鼠膀胱腫瘤過程中，選用華蟾素和臨床上常用的膀胱灌注藥物阿霉素、卡介苗等藥物，與誘導(dǎo)致癌物MNU交替行灌注治療，灌注結(jié)束一周后處死大鼠，病理結(jié)果提示運用華蟾素灌注的大鼠，其腫瘤的發(fā)生率與阿霉素組、卡介苗組相似，且華蟾素組大鼠的毛色、生長、飲食、活動等一般情況均較阿霉素組、卡介苗組為佳。林宇等［10］試驗表明:華蟾素大劑量靜脈注射和腹腔注射試驗(靜脈給藥和腹腔注射給藥的最大耐受量分別大于或等于50.0 g/kg、62.5 g/kg)也提示華蟾素無明顯的毒性反應(yīng);卡介苗及阿霉素的毒副作用相對較多，已經(jīng)在臨床上得到證實，與本實驗得出的結(jié)果一致。因此提示:華蟾素能有效地拮抗或抑制MNU誘導(dǎo)膀胱腫瘤的發(fā)生和進展，其抑制效果與臨床上常用的灌注藥物阿霉素、卡介苗效果相類似，且未發(fā)現(xiàn)有大鼠不適表現(xiàn)，提示華蟾素運用于膀胱癌的預(yù)防灌注較阿霉素、卡介苗的前景更有優(yōu)勢。華蟾素的抗膀胱腫瘤的可能作用機制［11－12］如下:①抑制血管內(nèi)皮細胞的生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞分化凋亡，從而抑制腫瘤細胞增殖;②具有免疫調(diào)節(jié)的功能;③顯著增強了大鼠單核吞噬細胞的吞噬功能及體液免疫功能，可有效增強繼發(fā)性免疫功能低下小鼠的細胞免疫作用。但華蟾素抑制腫瘤生成的具體機制尚要進一步研究，對華蟾素能否在臨床運用于膀胱腫瘤的灌注治療也仍需要按臨床試驗路徑進一步觀察。

［1］李建昌，柳建軍，凌生濤.華蟾素對SD大鼠膀胱腫瘤的抑制作用［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2012，34(8):726 －728.

［2］梁平，蒙富斌，王洪乾.華蟾素配合放療治療鼻咽癌近期療效觀察［J］.中國癌癥防治雜志，2009，1(2):148 －150.

［3］QI FANGHUA，LI ANYUAN，ZHAO LIN，et al.Cinobufacini，an aqueous extract from Bufo bufogargarizans Cantor，induces apoptosis through a mitochondria-mediated pathway in human hepatocellular carcinoma cells［J］.J Ethnopharmacol，2010，128(3):654 － 661.

［4］KERR JF，WYLLIE AH，CURRIE AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，1972，26(4):239 － 257.

［5］MIRKES PE.2001 Warkany lecture:to die or not to die，therole of apoptosis in normal and abnormal mammalian development［J］.Teratology，2002，65(5):228 －239.

［6］劉祥勝，劉開俊，楊業(yè)金.華蟾素對Hela細胞生長和小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2的影響［J］.免疫學(xué)雜志，2005，21(3):132－135.

［7］張靜.華蟾素聯(lián)合化療治療晚期惡性腫瘤療效分析［J］.腫瘤，2000，20(5):381.

［8］齊剛，張莉，何文彤，等.Bufalin的急性毒性研究［J］.武警醫(yī)院學(xué)報，2004，1(1):10 －11.

［9］李冶武，王黎玲.華蟾素注射液不良反應(yīng)文獻分析［J］.實用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2010，10(4):93 －94.

［10］林宇，付鑒，陳曉偉，等.華蟾素對肺癌抗癌作用的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，20(1):69 －70.

［11］王雙雙，李柏，翟笑楓，等.華蟾素注射液抗腫瘤應(yīng)用及其機制研究進展［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，32(5):436 －438.

［12］程文寧，肖家全.華蟾素抗腫瘤作用及其機制研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(8):1193 －1194.