十幾種貝母及其制劑中貝母素甲、乙及西貝堿的檢驗(yàn)方法和品質(zhì)的研究與進(jìn)展

蘇 健，王寶琹，林瑞超 （中國食品藥品檢定研究院，北京 100005）

貝 母 為 百 合 科 （Liliaceae）貝 母 屬（Fritillaria）的多種植物干燥鱗莖。本文收載了川貝母、暗紫貝母、梭砂貝母、浙貝母、平貝母、伊貝母、湖北貝母、澎澤貝母、瓦布貝母、皖貝母等十多種貝母的檢驗(yàn)方法，以及蛇膽川貝散、川貝枇杷含片、椰露止咳口服液、川貝枇杷糖漿、川貝雪梨膏、川貝枇杷含片、咳安含片、抗結(jié)核顆粒、樂欣膠囊、參北瓜口服液等制劑的含量測定方法。貝母具有清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消痛的功效，用于治療肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛帶嗽、痰中帶血、癆病、乳痛、肺痛［1］。最近報(bào)道貝母具有 M受體拮抗作用，治療肺結(jié)核［2］。貝母中含有貝母素甲（Peimine）、 貝 母 素 乙 （Peiminine） 及 西 貝 堿（Kashmirine）［3］等，對其成分進(jìn)行含量測定的方法有高效液相色譜法 （其中有質(zhì)譜聯(lián)用法、蒸發(fā)光散射檢測器法、紫外檢測器法、衍生化法）、薄層掃描法、氣相色譜法、差熱分析法、總生物堿滴定和比色測定法等。

1 提取方法

貝母中含有生物堿成分，提取方法：

（1）采用加氨水后用乙醚－氯仿－乙醇混合溶液超聲提取［4］或用氨水堿性浸泡再加氯仿－甲醇溶劑浸泡超聲提?。?］；有的直接用氨水－乙醇超聲提?。?］。

（2）藥品粉末用1.5%HCL 50 m L滲濾，收取滲濾液，用氨水調(diào)p H＝10，再用氯仿提?。?］。

2 含量測定

2.1 貝母素甲和貝母素乙的測定

2.1.1 高效液相色譜法

（1）質(zhì)譜聯(lián)用法

張雯杰等［4］采用了 HPLC－ESI／MS分析方法對川貝母、浙貝母中的貝母素甲、貝母素乙進(jìn)行了比較，此方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、簡便快捷。質(zhì)譜條件：電噴霧離子化，正離子采集模式 （ESI＋），掃描范圍為m／z 210～800，貝母素甲、貝母素乙的選擇檢測離子分別為m／z 432和m／z 430；液相條件：色譜柱為Sphrigel C18柱，流動(dòng)相為乙腈－10 mmol·L－1甲酸銨 （p H＝8.0，0.03%三乙胺），梯度洗脫。加樣回收率大于97%，含量測定結(jié)果：川貝母貝母素甲為0.009%～0.0034%，貝母素乙為0.004%～0.0042%；浙貝母中貝母素甲為0.0229%～0.0393%， 貝 母 素 乙 為 0.0184% ～0.0377%。

（2）蒸發(fā)光散射檢測器法 （HPLC－ELSD）

紫外檢測器應(yīng)用比較普遍，但只適用生色基團(tuán)物質(zhì)的檢測，由于大部分生物堿中少有或沒有共軛雙鍵，受到紫外末端檢測靈敏度低的影響，RP－HPLC定量分析方法一直沒有取得滿意的進(jìn)展。蒸發(fā)光散射檢測器是近年來迅速發(fā)展的一種質(zhì)量型檢測器，可以對高沸點(diǎn)物質(zhì)及無紫外吸收的化合物進(jìn)行定性定量分析［5］，見表1。

表1 用蒸發(fā)光散射檢測器法測定貝母素甲乙含量

（3）紫外檢測器法

吳曉民等［7］采用反相離子對高效液相色譜法測定平貝母中貝母素甲的含量，色譜條件：色譜柱Kromasil ODS C18，流動(dòng)相：甲醇－水（69∶31），檢測波長：208 nm，理論板數(shù)：3000以上，不同產(chǎn)地樣品含量在88.32～106.25μg·g－1之間。

（4）柱前衍生化法

貝母素乙屬于甾體生物堿，其特異性UV吸收峰為290 nm，由于吸收強(qiáng)度較弱，無法滿足樣品中貝母素乙含量測定的要求。因貝母素乙結(jié)構(gòu)中含有酮基，很容易與2，4－二硝基苯肼反應(yīng)，選擇UV 375 nm，測定貝母素乙苯腙衍生物能滿足測定要求，見表2。

表2 柱前衍生化法測定貝母素乙含量

2.1.2 薄層掃描法

薄層掃描法測定中成藥中貝母生物堿，具有簡便快速易行，且不需要采用特殊檢測器的問題。薄層板：①硅膠G板；②硅膠G－CMC－Na板。顯色條件：①稀碘化鉍鉀溶液，再噴亞硝酸鈉溶液，斑點(diǎn)穩(wěn)定；②改良碘化鉍鉀溶液。掃描方式：雙波長踞齒掃描或線性掃描，λS＝500 nm，λR＝650 nm；單波長，λS＝495 nm，見表3。

2.1.3 氣相色譜法

李松林［16］采用柱前衍生化氣相色譜法，先使三甲基硅烷咪唑與貝母甾體生物堿反應(yīng)生成衍生物，以正三十烷為內(nèi)標(biāo)，對國產(chǎn)16種藥用貝母中活性異甾體生物堿進(jìn)行了分析研究，認(rèn)為重現(xiàn)性好，靈敏度高，操作簡便；還嘗試采用直接氣相色譜法，在Supelco SAC－5柱上，以氮?dú)庾鳛檩d氣，對7種主要貝母中異甾體生物堿進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明該方法較柱前衍生化氣相色譜法，具有耗時(shí)少，重現(xiàn)性和精密度高的優(yōu)點(diǎn)［17］。

2.1.4 差熱分析法

程存歸等［18］采用高效液相色譜法 （HPLC）及差熱分析法 （DTA）評價(jià)了在相同生態(tài)環(huán)境條件下采用不同加工方法得到的浙貝母、東貝母、湖北貝母及皖貝母的質(zhì)量。HPLC色譜條件：色譜柱為Sphels orb C18，流動(dòng)相為乙腈－100 mmo L·L－1醋酸銨 （41∶59，p H＝5.0），檢測波長為375 nm，柱前衍生化法。DTA實(shí)驗(yàn)條件：差熱量程±50μV，升溫速率20℃·min－1，升溫范圍30～550℃，氣氛為靜態(tài)空氣，參比物為空坩堝，見表4。

2.2 西貝堿的測定

2.2.1 高效液相色譜法

由于西貝堿在結(jié)構(gòu)上無共軛雙鍵，很難用HPLC－UV法、氣相色譜法進(jìn)行分析，有報(bào)道采用HPLC與通用型檢測器蒸發(fā)光散射檢測器ELSD聯(lián)用，分析貝母生物堿［19］，見表5。

表5 蒸發(fā)光散射檢測法測定貝母中西貝堿含量

2.2.2 薄層掃描法

采用薄層掃描法分析貝母制劑中西貝堿的含量報(bào)道，見表6。

2.3 總生物堿的含量測定法

2.3.1 比色法

余江平［21］采用分光光度法，以西貝堿為對照品，以溴甲酚綠為顯色劑，在416 nm波長下測定貝母中總生物堿含量。結(jié)果：濃密貝母為0.182%（n＝6），瓦布貝母為0.218% （n＝6），平均回收率為8.76%，RSD＝2.0% （n＝6）。因此，酸性染料比色法是測定貝母類總生物堿最常用可靠的方法。

表6 貝母制劑中西貝堿的含量測定

2.3.2 滴定法

杜建紅等［29］采用兩相滴定法對瓦布貝母（Fritillaria Wabueusi）的野生松貝、家種松貝、家種青貝進(jìn)行了總生物堿的測定。提取方法：采用中性、酸性兩種提取液，以溴麝香草酚藍(lán)溶液兩次滴定測定，以西貝堿計(jì)，測定總生物堿的百分含量，測得野生松貝為0.103%、家種松貝為0.148%、家種青貝為0.120%，結(jié)論：3種川貝母總生物堿含量高于野生品。

3 討論

川貝母中的甾體生物堿按其結(jié)構(gòu)分為兩大類，異甾體生物堿和甾體生物堿：異甾體生物堿為C3、C17雙氫反式構(gòu)型的5α－cevaine，如貝母素甲、貝母素乙；甾體生物堿為C1、C17雙氫順式結(jié)構(gòu)，如西貝堿、川貝酮等［5］。已分離確定結(jié)構(gòu)的貝母生物堿100余種，其中異甾體生物堿占75%，貝母屬植物中含較多異甾體生物堿，而且貝母中的生物堿大多數(shù)為藜蘆類生物堿，如貝母素甲、貝母素乙、西貝素等。

《中國藥典》2005年版和2010年版收載了用HPLC－ELSD法檢測浙貝母中貝母素甲、貝母素乙含量的方法，但因川貝母中這兩種生物堿含量較低，此方法靈敏度偏低，有時(shí)無法檢測。質(zhì)譜聯(lián)用法 （HPLC－MS）由于具有靈敏度高、分離能力強(qiáng)、適用范圍寬、專屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在生物堿分析中得到廣泛的應(yīng)用，一般化合物都能被電離而得到檢測，對于弱紫外吸收的化合物更為適用［4］。張雯杰［4］在測定貝母生物堿時(shí)用LC－MS軟件系統(tǒng)提供的選擇離子功能，分別選擇m／z 432和m／z 430兩個(gè)峰作為選擇離子，可確定通過與對照品對比兩個(gè)峰的保留時(shí)間在16.45 min和21.18 min的物質(zhì)分別為貝母素甲和貝母素乙。

平貝母臨床常做川貝母應(yīng)用，川貝母和平貝母都是百合科植物L(fēng)iliaceae，其性味、功能主治、用法用量基本相同，而且藥理化學(xué)成分和藥用上都有共性，屬同類同效品種。

川貝母分布在四川、西藏、云南、甘肅，海拔3000～4000米的山地區(qū)域，川貝母藥效獨(dú)特，由于市場需求量大及再生困難等原因，野生川貝母資源日漸枯竭，已瀕危。國家 “十五”重大科技專項(xiàng)建立了 “瀕危藥材川貝母野生撫育，人工栽培及種子種苗人工繁育研究”項(xiàng)目，因此川貝母的栽培是當(dāng)前重要的任務(wù)［19］，對其質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)研究也極為重要。《中國藥典》2010年版一部收載的川貝母、平貝母為總生物堿測定法；伊貝母為HPLC法測定西貝堿、西貝堿苷總量之和；湖北貝母為HPLC法測定貝母素乙；浙貝母為液相蒸發(fā)光散射器法 （HPLC－ELSD）測定貝母素甲、貝母素乙。本文收載的檢驗(yàn)方法，尤其質(zhì)譜聯(lián)用法、蒸發(fā)光散射檢測器法可供修訂 《中國藥典》參考。

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