生脈注射液指紋圖譜的優(yōu)化

鄭笑為，汪 祺，劉 燕，于建東，戴 忠，魯 靜，林瑞超 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

生脈注射液為華西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院根據(jù)我國(guó)古驗(yàn)方 “生脈散”研制而成，由紅參、麥冬、五味子經(jīng)提取后制成的滅菌水溶液。該品種具有益氣養(yǎng)陰、復(fù)脈固脫的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有擴(kuò)張血管與增進(jìn)冠狀動(dòng)脈血流量的作用，臨床上可用于治療心肌梗塞、心源性休克、感染性休克及其他微循環(huán)障礙［1］。目前全國(guó)共有8家企業(yè)生產(chǎn)，針對(duì)生脈注射液不同成分進(jìn)行的研究曾有文獻(xiàn)報(bào)道［2－9］。為控制本品的質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性和有效性，本試驗(yàn)樣品經(jīng)過C18柱和大孔樹脂處理比較后，經(jīng)過多次調(diào)整梯度洗脫程序，確立采用HPLC法對(duì)8個(gè)廠家的樣品進(jìn)行了測(cè)定，建立了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，由23個(gè)特征峰組成。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695型液相色譜儀。

1.2 試藥

對(duì)照品：人參皂苷 Rg1（批號(hào)：110703－201027）、Re （批號(hào)：110754－200822）、Rf（批號(hào)：111719－200703）、Rb1（批 號(hào)：110704－200921）、Rg2（批 號(hào)：111779－200801）、Rb2（批 號(hào)：111715－200802）、Rb3（批號(hào)：111686－201002），五味子醇甲（批號(hào)：110857－201010），原人參三醇（批 號(hào)：111755－200601），五味子甲素（批 號(hào)：110764－200609）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。被測(cè)樣品均由生脈注射液生產(chǎn)企業(yè)提供，批號(hào)見表1。乙腈為色譜純 （Merck公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry ShieldTMRP18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相及洗脫程序見表2，流速：1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20μL。

表2 流動(dòng)相及洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rg2、Rb2、Rb3、Rd、原人參三醇對(duì)照品約5 mg，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品約2 mg，于10 m L量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品20 mL，通過AB－8大孔樹脂 （大孔樹脂10 g，直徑1.5 cm），用25%乙醇150 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用95%乙醇150 mL，洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得。

2.4 樣品測(cè)定

2.4.1 共有峰的確定

通過對(duì)多批樣品的測(cè)定，選擇穩(wěn)定性好、吸收強(qiáng)、特征明顯的色譜峰為共有峰，共標(biāo)定23個(gè)峰。其中以現(xiàn)有對(duì)照品為參照標(biāo)記了12個(gè)峰的歸屬。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 生脈注射液混合對(duì)照品色譜圖

2.4.2 8家企業(yè)指紋圖譜

隨機(jī)抽取8個(gè)企業(yè)各1批樣品生成對(duì)照?qǐng)D譜，對(duì)選定的23個(gè)特征峰進(jìn)行mark峰匹配，非共有峰面積均小于10%，結(jié)果見表3、圖3。

圖2 生脈注射液典型色譜圖

表3 企業(yè)指紋圖譜mark峰相似度結(jié)果

圖3 8家企業(yè)生產(chǎn)的生脈注射液指紋圖譜

3 討論

3.1 樣品前處理

3.1.1 經(jīng)C18小柱處理

取本品3 mL過C18小柱，分別用20 mL水洗，10%，25%，50%，75%，95%乙醇分段洗脫，收集洗脫液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解；另取本品3 mL過C18小柱，用95%乙醇洗脫，收集洗脫液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解；再取本品3 mL過C18小柱后直接進(jìn)樣，結(jié)果見圖4。采用95%乙醇直接洗脫效果較好，指紋圖譜信息較多，但基線分離較差。

3.1.2 經(jīng)大孔樹脂處理

取本品20 m L，通過AB－8大孔樹脂 （大孔樹脂10 g，直徑1.5 cm），分別用150 m L水洗，10%，25%，50%，75%，95%乙醇分段洗脫，收集洗脫液蒸干，殘?jiān)蛹状? m L使溶解；另取本品20 m L過大孔樹脂柱，用95%乙醇洗脫，收集洗脫液蒸干，殘?jiān)蛹状? m L使溶解；再取本品直接進(jìn)樣，結(jié)果見圖5。采用95%乙醇直接洗脫效果較好，指紋圖譜信息較多，且基線分離比較好。

比較經(jīng)過C18小柱和大孔樹脂柱處理的樣品指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)過大孔樹脂后，直接用95%乙醇洗脫效果更好，但在40～50 min附近與原液直接進(jìn)樣相似，基線不平雜質(zhì)較多，采用20%和25%乙醇150 m L先除去一些雜質(zhì)，再用95%乙醇洗脫，結(jié)果見圖6。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)原標(biāo)準(zhǔn)提供的指紋圖譜液相條件，分離效果不好，集中在60 min后出峰，且100%的水或乙腈的比例會(huì)影響色譜柱的使用壽命。曾選用不同溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，乙腈－水、甲醇－水、乙腈－0.1%磷酸等溶劑系統(tǒng)，結(jié)果表明，乙腈－水梯度洗脫效果最佳。

圖7為不同梯度條件的液相色譜圖。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

《中國(guó)藥典》2010年版一部人參項(xiàng)下采用203 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定人參皂苷的含量。取本品測(cè)定，分別得到其在203，210，220，230和254 nm 5個(gè)波長(zhǎng)下的色譜圖。隨著波長(zhǎng)的增加，色譜峰數(shù)目減少且峰面積變小，在203 nm波長(zhǎng)處色譜峰數(shù)目最多且峰面積最大，故最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

本試驗(yàn)方法已經(jīng)進(jìn)行了方法學(xué)考察，方法可行［10－11］。

［1］夏晶，王鋼力，季申，等.HPLC測(cè)定生脈注射液中4種成分的含量 ［J］.中成藥，2006，28 （1）：27－30.

［2］陸娟，李緒文，魏巍，等.RP－HPLC測(cè)定生脈注射液中7個(gè)人參皂苷類成分的含量 ［J］.藥物分析雜志，2011，31（12）：2302－2304.

［3］白晶，張磊，于治國(guó)，等.RP－HPLC法同時(shí)測(cè)定生脈注射液中人參皂苷Rb1與五味子醇甲的含量 ［J］.藥物分析雜志，2006，12 （11）：1585－1587.

［4］曹樹萍，聶黎行，王鋼力.HPLC法同時(shí)測(cè)定參脈注射液中9個(gè)人參皂苷的含量 ［J］.藥物分析雜志，2011，31（3）：476－479.

［5］陳志清，徐柏頤.HPLC測(cè)定生脈注射液中人參皂苷Re的含量 ［J］.中國(guó)中藥雜志，1999，24 （1）：36－38.

［6］夏晶，王鋼力，季申，等.生脈注射液HPLC指紋圖譜的研究 ［J］.中成藥，2006，28 （8）：1093－1095.

［7］徐世霞.HLPC法測(cè)定生脈注射液中5－羥甲基糠醛的含量［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2011，14：36－39.

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［9］張萍，張南平，肖新月，等.人參皂苷類成分的化學(xué)研究［J］.藥物分析雜志，2004，24 （3）：229－231.

［10］鄭笑為，汪琪，于建東，等.生脈注射液HPLC指紋圖譜的建立 ［J］.藥物分析雜志，2012，32 （8）：1471－1475.

［11］汪琪，鄭笑為，于建東，等.生脈注射液超高效液相色譜指紋圖譜的建立及特征成分分析 ［J］.藥物分析雜志，2012，32 （10）：1813－1817.