A組鏈球菌M蛋白重組多肽原核表達(dá)載體構(gòu)建及融合蛋白的表達(dá)①

丁月霞 倪瓊瓊 劉金來 (廣州醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣州510700)

A組 β溶血性鏈球菌(Group A β-hemolytic streptococci，GAS)感染引起的風(fēng)濕熱和風(fēng)濕心臟病(Rheumatic fever/rheumatic heart diseases，RF/RHD)是嚴(yán)重危害青少年和成人健康的疾病，研制安全、有效的GAS疫苗將有助于預(yù)防致咽炎GAS引起的RF/RHD，對減輕病人和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)有積極的意義?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)M蛋白位于GAS的細(xì)胞壁上，具有抗吞噬作用，是制備GAS疫苗的理想抗原。我們在前期有關(guān)GAS的攜帶流行狀況及編碼其M蛋白的emm基因分型的研究表明，近期流行型為emm1和emm12[1];我們借鑒了國外學(xué)者有關(guān)A組鏈球菌M蛋白疫苗的候選基因序列的成功經(jīng)驗，以其編碼的M蛋白信號肽后35個氨基酸和相同保守區(qū)的J14肽串聯(lián)起來作為免疫原[1-3]，即作為抗A組β溶血性鏈球菌M蛋白的候選疫苗，以此為設(shè)想合成含有編碼該重組多肽或蛋白的基因序列，并構(gòu)建該段核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒，以進(jìn)一步誘導(dǎo)GST融合蛋白的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)菌 T載體(實驗室提供)、大腸桿菌(E.coli)BL21菌株(上海申工)、pGEX-4T-1質(zhì)粒(BV Tech公司)。

1.1.2 試劑(盒) HSTMTaq Mix Kit購自東盛生物公司，預(yù)染蛋白 Marker購自 Ferment公司，BamHⅠ/XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、T4 DNA連接酶、T4磷酸激酶均購自大寶生物公司，異丙基-β-巰基半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG) 以及Western blot所需試劑耗材均購自Sigma公司，PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒購自東盛生物公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN公司，抗兔GST單克隆抗體購自CST公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Santacruz公司，X膠片、曝光盒購自廣州安布雷拉公司，BioRAD蛋白電泳裝置(美國BioRAD公司)，MALDITOF-TOF質(zhì)譜儀:UltraflexⅢ(德國布魯克)。

1.2 方法

1.2.1 GAS重組M蛋白多肽疫苗抗原區(qū)段的選擇以及核苷酸引物設(shè)計 根據(jù)前期emm基因測序結(jié)果分析[1，4]，選擇編碼信號肽后 35 個氨基酸(屬于M蛋白的型特異區(qū))的核苷酸序列作為目的基因;同時我們的測序結(jié)果還發(fā)現(xiàn)emm1和emm12 C端保守區(qū)J14肽的核苷酸序列一致，故我們設(shè)計將分別編碼GASM蛋白(emm1和emm12)信號肽后35個氨基酸和 J14肽的核苷酸序列串聯(lián)[5-7]起來(GGTTTTGCGAATCAAACAGAGGTTAAGGCTAACGGTGATGGTAATCCTAGGGAAGTTATAGAAGATCTTGCAGCAAACAATCCCGCAATACAAAATATACGTTTAGATCATAGTGATTTAGTCGCAGAAAAACAACGTTTAGAAGATTTAGGACAAAAATTTGAAAGACTGAAACAGCGTTCAGAACTCTACCTTCAGCAATACTATGATGCATCACGTGAAGCTAAAAAACAAGTTGAAAAAGCTTTAGAA)。根據(jù)Oligo6軟件分析，得出重組基因?qū)儆诔Ｒ?guī)基因序列，平均GC含量為37.04，將此重組基因序列分成6個片段，共合成了12條引物(含有保護(hù)性堿基，上海捷瑞生物工程有限公司)，Primer 1和Primer 12分別包含有BamHⅠ/XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。該段基因序列編碼84個氨基酸(GFANQTEVKANGDGNPREVIEDLAANNPAIQNIRLDHSDLVAEKQRLEDLGQKFERLKQRSELYLQQYYDASREAKKQVEKALE，約9.6 kD)通過和 CDC數(shù)據(jù)庫比對確定和各組織均無任何同源性，具有良好的免疫原性。

1.2.2 核苷酸引物片段 Primer 1:ACTTAGGATCCATGGGTTTTGCGAATCAAACAGAGGTT(含有BamHⅠ酶切位點(diǎn));Primer 2:GATTACCATCACCGTTAGCCTTAACCTCTGTTTGATTCGCAAAA;Primer 3:AAGGCTAACGGTGATGGTAATCCTAGGGAAGTTATAGAAGATCT;Primer 4:TATTGCGGGATTGTTTGCTGCAAGATCTTCTATAACTTCCCTAG;Primer 5:TGCAGCAAACAATCCCGCAATACAAAATATACGTTTAGATCATAGT;Primer 6:GTTGTTTTTCTGCGACTAAATCACTATGATCTAAACGTAl-TATTTTG;Primer 7:GATTTAGTCGCAGAAAAACAACGTTTAGAAGATTTAGGACAAAAAT;Primer 8:GAACGCTGTTTCAGTCTTTCAAATTTTTGTCCTAAATCTTCTAAAC;Primer 9:TTGAAAGACTGAAACAGCGTTCAGAACTCTACCTTCAGCAATAC;Primer 10:TAGCTTCACGTGATGCATCATAGTATTGCTGAAGGTAGAGTTCT;Primer 11:TATGATGCATCACGTGAAGCTAAAA-AACAAGTTGAAAAAGCTTT;Primer 12:ACTTACTCGAGTTATTCTAAAGCTTTTTCAACTTGTTTTT(含有 XhoⅠ的酶切位點(diǎn))。

1.2.3 重疊PCR以及原核表達(dá)載體構(gòu)建 上述混合引物 5 μl、Primer 1:2 μl、Primer 12:2 μl、Taq 酶1 μl、超純水 13 μl、Buffer 1 μl、dNTP 1 μl，25 μl反應(yīng)體系;反應(yīng)條件:94℃ 20秒;54℃ 20秒;72℃ 12秒，20個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物純化后連入T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，質(zhì)粒測序、挑選正確的單克隆;將測序正確的連入T載體的質(zhì)粒用BamHⅠ/XhoⅠ把270 bp的目的片段切下來;同時用BamHⅠ/XhoⅠ對空質(zhì)粒(pGEX-4T-1，pG)進(jìn)行酶切;回收需要的片段和酶切后的空載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化BL21，挑取單克隆培養(yǎng)，然后提質(zhì)粒、酶切鑒定并測序，挑選正確的克隆，構(gòu)建含有目的片段的重組質(zhì)粒(pGEX-4T-1-emm1-12-J14，pE)的大腸桿菌BL21菌株(pE/B)。

1.2.4 GST融合蛋白(GST/emm)誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.4.1 GST/emm基礎(chǔ)表達(dá) 將BL21轉(zhuǎn)接至無氨芐抗性的LB平板上，同時分別將pG/B(轉(zhuǎn)化了空質(zhì)粒pG的大腸桿菌BL21)和pE/B(轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pE的大腸桿菌BL21)菌株轉(zhuǎn)接至氨芐抗性的LB平板上;37℃培養(yǎng)過夜后各挑取單克隆菌落到1 ml LB培養(yǎng)基中(Amp 100 μg/ml)，過夜振蕩培養(yǎng)(12～16小時，180～200 r/min，37℃)后以1∶100比例將菌液轉(zhuǎn)接于2 ml LB培養(yǎng)基中(Amp 100 μg/ml)，劇烈振蕩培養(yǎng)2小時(220 r/min，37℃，OD 值約0.6～0.8，下同)。取出1 ml菌液不加IPTG，作為陰性對照;另外1 ml加入終濃度為1 mmol/L的IPTG 25℃誘導(dǎo) 2小時后，收集菌液離心(4℃，12 000 r/min，5分鐘)、棄上清，細(xì)菌沉淀重懸于100 μl 1×SDS上樣緩沖液中(使用前加入終濃度為0.1 mmol/L的DTT);冰上超聲裂解，3秒×3～5次;短暫高速離心后100℃水浴5分鐘;4℃，12 000 r/min，5分鐘離心，冰上放置，等全部樣品處理完后一起進(jìn)行12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(200 V，40分鐘)、考馬斯亮藍(lán)染色40分鐘和脫色后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照;并進(jìn)一步通過Western blot檢測GST融合蛋白表達(dá)(下同)。

1.2.4.2 IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達(dá)的時效性 分別取適量上述振蕩培養(yǎng)過夜的pG/B和pE/B菌液，按照1∶100轉(zhuǎn)接于所需要的LB培養(yǎng)基中(Amp 100 μg/ml)，劇烈振蕩培養(yǎng)2 小時(220 r/min，37℃，OD值約0.6～0.8)后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG 25℃分別誘導(dǎo)0、2、6、8、18 和24 小時(pG/B 只做未誘導(dǎo)和2小時誘導(dǎo)組)，其余處理同上。

1.2.4.3 不同濃度的IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達(dá)在上述步驟中，分別加入終濃度為 0.01、0.1、1 mmol/L的IPTG在25℃誘導(dǎo)8小時，其余同上(pG/B只做未誘導(dǎo)和1 mmol/L誘導(dǎo)組)。

1.2.4.4 不同溫度下IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達(dá)在不同溫度 (25℃、30℃、37℃)，以終濃度為1 mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)8小時，其余步驟同上，將聚丙烯酰胺凝膠上的目的條帶(35.6 kD)切下進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析(由中山大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)實驗室完成)。

1.2.5 Western blot檢測GST/emm的表達(dá) IPTG誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組(只做上述的基礎(chǔ)表達(dá)組和pE/B的時間組與濃度組)取1 ml菌液如上處理，每條泳道上樣量為20 μg(約25 μl上述細(xì)菌裂解液)。進(jìn)行12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后經(jīng)半干電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(100 V、60分鐘)，在室溫下用封閉緩沖液(5%脫脂奶粉，含0.1%TWEEN20的 TBS配制)封閉1小時，洗膜、兔抗GST單克隆抗體為一抗(1∶2 000稀釋)4℃孵育過夜、洗膜后與 HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG，二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1小時，洗膜后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X線底片曝光1分鐘顯影，并進(jìn)行灰度掃描。

1.2.6 質(zhì)譜分析檢測融合蛋白GST/emm 用刀片切取1～2 mm膠粒，置于1.5 ml EP管中、清洗(用200 μl MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘)、脫色(對于考染膠，加25 mmol/L NH4HCO3和50%ACN考染脫色液200 μl、37℃、20分鐘或超聲脫色5分鐘、吸干;重復(fù)脫色2～3次，至藍(lán)色褪去)、脫水(加ACN 100 μl脫水至膠粒變白，吸棄 ACN);加10 mmol/L DTT 50 μl，37℃1 小時;冷至室溫，快速加IAA 30 mmol/L 50 μl，置于暗室 45 分鐘;清洗:用200 μl MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘;然后用200 μl 50%ACN震蕩清洗2次，每次10分鐘;脫水:加ACN 100 μl脫水至膠粒變白，吸棄ACN;用25 mmol/L NH4HCO3稀釋 Trypsin 至12.5 mg/ml，每管加10 μl，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4℃放置30分鐘 ，待酶液被膠粒完全吸收，吸棄多余的酶液，加 25 mmol/L NH4HCO315 μl，37℃過夜(16小時)。然后AnchorChip靶點(diǎn)樣。最后進(jìn)行質(zhì)譜分析以上制備的樣品，使用德國Bruker公司的UltraflexⅢ質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。所獲得圖譜使用Biotools軟件檢索，以 MASCOT(Matrix Science，London，UK)為搜索引擎。搜索參數(shù)設(shè)置:數(shù)據(jù)庫為自建序列數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)檢索的方式為combined;最大允許漏切位點(diǎn)為1;酶為胰蛋白酶。質(zhì)量誤差范圍設(shè)置:PMF50ppm，MS/MS0.5Da。

2 結(jié)果

2.1 Overlap-PCR結(jié)果 如圖1所示，通過Overlap-PCR合成的重組DNA目的序列接近272 bp，通過瓊脂糖凝膠回收、純化并測序(上海捷瑞生物工程有限公司完成)，結(jié)果與設(shè)計之初的序列完全符合，可以用于下一步的表達(dá)載體構(gòu)建。如圖2所示用BamHⅠ和XhoⅠ快速型限制性內(nèi)切酶雙酶切空質(zhì)粒(pG)和重組質(zhì)粒(pE)，后者可見目的片段約252 bp，并將pE測序鑒定，重組核苷酸序列的編碼框正確，編碼84個氨基酸。

2.2 成功構(gòu)建含目的片段的pGEX-4T-1-emm1-12-J14(pE)重組質(zhì)粒 圖3為我們所構(gòu)建的含目的DNA的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖，我們選擇了高效的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S transferase，GST)標(biāo)記的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)(pGEX-4T-1，pG)，該質(zhì)粒作為空質(zhì)粒與所克隆的目的片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒pE的大腸桿菌BL21菌株。

2.3 GST/emm誘導(dǎo)表達(dá)

圖1 Overlap PCR電泳圖Fig．1 1．5%Agarose gel electrophoretic profiles of recombinant emm gene amplified by Overlap PCR

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切1．5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig．2 1．5%Agarose gel electrophoretic profiles of recombinant plasmid cleavage with Bam HⅠ/XhoⅠ

2.3.1 GST/emm基礎(chǔ)表達(dá) 如圖4所示，E.coli BL21無論誘導(dǎo)與否均無GST(26 kD)和GST融合蛋白(GST/emm，約35.6 kD)表達(dá);表達(dá)空質(zhì)粒(pG)的BL21未誘導(dǎo)時無GST表達(dá);而轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒(pGEX-4T-1-emm1-12-J14，pE)的 BL21無GST/emm表達(dá)，誘導(dǎo)后GST/emm明顯過量表達(dá)。

2.3.2 IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達(dá)的時效性 如圖5所示，1 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒的BL21(pE/B)0、2、6、8、18、24 小時后，GST 融合蛋白(GST/emm)的表達(dá)在2小時就比較明顯，在6～8小時達(dá)高峰，18小時和24小時時有所下降，但依舊是過量表達(dá)。

圖3 pGEX-4T-1/emm1-12-J14結(jié)構(gòu)示意圖Fig．3 The structure diagram of pGEX-4T-1/emm1-12-J14

圖4 IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白在E．coli BL21中的表達(dá)Fig．4 The expression of inducible protein with IPTG

表1 GST/emm質(zhì)譜分析結(jié)果Tab．1 The fusion protein(GST/emm)examined with MALDI-TOF MS

圖5 IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達(dá)的時間效應(yīng)Fig．5 The expression of GST/emm induced with IPTG at different times

圖6 IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達(dá)的濃度效應(yīng)Fig．6 The expression of GST/emm induced with different concentrations of IPTG

2.3.3 不同濃度和溫度下IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白的表達(dá) 如圖6所示，12%SDS-PAGE和Western blot結(jié)果均表明不同濃度的 IPTG(0.01、0.1、1 mmol/L)誘導(dǎo)pE/B 8小時時表達(dá)GST/emm融合蛋白在較低濃度時即有明顯表達(dá)，隨濃度增加表達(dá)有所增加。1 mmol/L IPTG在不同溫度下誘導(dǎo)GST/emm表達(dá)均為過量表達(dá)，溫度對融合蛋白表達(dá)量的影響不明顯，見圖7。

圖7 溫度對IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達(dá)Fig．7 The expression of GST/induced with IPTG under different tempreatures

圖8 GST/emm質(zhì)譜檢測結(jié)果Fig．8 The fusion protein(GST/emm)examined with MALDI-TOF MS

2.4 GST/emm質(zhì)譜檢測結(jié)果 如表1和圖8所示:蛋白質(zhì)譜分析gi|21305379(自建數(shù)據(jù)庫)是以重組蛋白的氨基酸序列(如前所述，M蛋白信號肽后的35個氨基酸和J14肽序列串聯(lián))建立數(shù)據(jù)庫，GST/emm質(zhì)譜分析結(jié)果與該數(shù)據(jù)庫比對，如果分?jǐn)?shù)超過16分即可確定誘導(dǎo)的融合蛋白正確，蛋白質(zhì)譜分析確定35.6 kD處的條帶是GST/emm，可以進(jìn)行下一步實驗。

3 討論

眾所周知GAS可以引發(fā)多種感染性和感染后自身免疫性疾病，尤其在發(fā)展中國家由其導(dǎo)致的風(fēng)濕熱以及風(fēng)濕性心臟病仍有較高的發(fā)病率和致殘致死率，所以近年來各國學(xué)者一直致力于針對GAS的疫苗研制[4，7]。由 emm 基因編碼的 M 蛋白作為GAS最重要的毒力因子之一是熱門的候選免疫原。目前歐美國家已經(jīng)成功構(gòu)建針對M蛋白的多價疫苗并進(jìn)行了臨床試驗[5-8]。但是各個地區(qū)和國家致病型GAS的流行情況不同，編碼其主要毒力因子M蛋白的emm基因分型也不盡相同，這就需要不同國家或者地區(qū)進(jìn)行相關(guān)GAS及其emm分型的流行病學(xué)調(diào)查以便選出適合本國的針對M蛋白的疫苗候選基因，這一項工作我們在前期已經(jīng)完成[1]。

我們之所以選擇編碼M蛋白信號肽后35個氨基酸的核苷酸序列作為目的基因，是因為此區(qū)為GAS M蛋白型特異性的高變區(qū)，且信號肽后的這部分序列與人的組織無交叉免疫反應(yīng)，通常把該區(qū)編碼的多肽序列作為候選疫苗。我們的測序結(jié)果還發(fā)現(xiàn)emm1和emm12 C端保守區(qū)J14肽的核苷酸序列一致，現(xiàn)在的動物實驗已經(jīng)證明了GAS不同亞型的C端保守區(qū)編碼的J14或J8肽具有很好的免疫原性，是保護(hù)性抗原，它們可以刺激動物產(chǎn)生保護(hù)性抗體[2，6]。故通過分子克隆技術(shù)將致咽炎GAS的2型emm(1和12)編碼信號肽后35個氨基酸的基因與j14肽的基因串聯(lián)起來，由其編碼的重組蛋白在NCBI與人的對該氨基酸序列比對無任何同源性，可作為很好的疫苗候選者。重疊PCR是根據(jù)目的基因的核苷酸序列，將目的基因分成70～90 bp不等的多條引物，分段進(jìn)行合成;利用相連片段間20～30 bp重疊的核苷酸部分互相搭橋、互為模板，通過幾輪連續(xù)的PCR反應(yīng)將各片段粘合在一起，組合成為目的基因。該技術(shù)的關(guān)鍵在于核苷酸引物的設(shè)計、退火溫度的控制以及首尾重疊部分(一般需要25 bp)。我們通過引物設(shè)計軟件，將目的基因分成6個片段、共設(shè)計了12條引物，同時引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(見方法與結(jié)果)，成功合成了編碼候選多肽的全基因序列;并進(jìn)一步構(gòu)建了GST標(biāo)簽的重組質(zhì)粒、成功轉(zhuǎn)化E.coli BL21、建立了穩(wěn)定表達(dá)目的基因的大腸桿菌株系。

GST標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)載體業(yè)已成熟尤其在融合蛋白的可溶性表達(dá)以及維持蛋白表達(dá)后的生物活性上有其獨(dú)到之處。我們選擇帶有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1作為表達(dá)載體，將重組的DNA目的片段克隆到該載體上，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)體系。該質(zhì)粒含有凝血酶專一酶切位點(diǎn)，為大量誘導(dǎo)表達(dá)和純化融合蛋白以及切去GST標(biāo)簽，獲得目的蛋白或多肽提供了很大的可能性。我們利用構(gòu)建好的含有編碼M蛋白目的基因的重組質(zhì)粒，成功通過IPTG誘導(dǎo)了GST融合蛋白的過量表達(dá)，摸索出最佳表達(dá)條件。誘導(dǎo)結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE、Western blot以及蛋白質(zhì)譜分析目的條帶均正確，其中質(zhì)譜分析是目前較為先進(jìn)的檢測多肽片段的蛋白質(zhì)實驗技術(shù)。該技術(shù)是一種新型的檢測多肽或蛋白質(zhì)的方法，尤其是在沒有成熟的單克隆抗體或檢測小分子多肽時[9]，其原理是:通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。我們的研究中利用所設(shè)計的重組多肽氨基酸序列自建數(shù)據(jù)庫，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析目的多肽或融合蛋白，結(jié)果表明GST/emm中多肽分子量和氨基酸正確，與自建數(shù)據(jù)庫相匹配。這就為下一步候選免疫原蛋白的大量表達(dá)純化、酶切以及下游的動物實驗奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 丁月霞，倪瓊瓊，劉金來.廣州市兒童致咽炎β溶血性鏈球菌的流行情況及其emm基因分型[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2011;32(3):411-415.

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9 陳紹農(nóng)，潘遠(yuǎn)江，陳耀祖.多肽及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析新進(jìn)展[J].質(zhì)譜學(xué)報，1995;16(3):15-21.