A組鏈球菌M蛋白重組多肽原核表達載體構(gòu)建及融合蛋白的表達①

丁月霞 倪瓊瓊 劉金來 (廣州醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣州510700)

A組 β溶血性鏈球菌(Group A β-hemolytic streptococci，GAS)感染引起的風(fēng)濕熱和風(fēng)濕心臟病(Rheumatic fever/rheumatic heart diseases，RF/RHD)是嚴(yán)重危害青少年和成人健康的疾病，研制安全、有效的GAS疫苗將有助于預(yù)防致咽炎GAS引起的RF/RHD，對減輕病人和社會的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)有積極的意義?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)M蛋白位于GAS的細胞壁上，具有抗吞噬作用，是制備GAS疫苗的理想抗原。我們在前期有關(guān)GAS的攜帶流行狀況及編碼其M蛋白的emm基因分型的研究表明，近期流行型為emm1和emm12[1];我們借鑒了國外學(xué)者有關(guān)A組鏈球菌M蛋白疫苗的候選基因序列的成功經(jīng)驗，以其編碼的M蛋白信號肽后35個氨基酸和相同保守區(qū)的J14肽串聯(lián)起來作為免疫原[1-3]，即作為抗A組β溶血性鏈球菌M蛋白的候選疫苗，以此為設(shè)想合成含有編碼該重組多肽或蛋白的基因序列，并構(gòu)建該段核苷酸序列的重組表達質(zhì)粒，以進一步誘導(dǎo)GST融合蛋白的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細菌 T載體(實驗室提供)、大腸桿菌(E.coli)BL21菌株(上海申工)、pGEX-4T-1質(zhì)粒(BV Tech公司)。

1.1.2 試劑(盒) HSTMTaq Mix Kit購自東盛生物公司，預(yù)染蛋白 Marker購自 Ferment公司，BamHⅠ/XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、T4 DNA連接酶、T4磷酸激酶均購自大寶生物公司，異丙基-β-巰基半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG) 以及Western blot所需試劑耗材均購自Sigma公司，PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒購自東盛生物公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN公司，抗兔GST單克隆抗體購自CST公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Santacruz公司，X膠片、曝光盒購自廣州安布雷拉公司，BioRAD蛋白電泳裝置(美國BioRAD公司)，MALDITOF-TOF質(zhì)譜儀:UltraflexⅢ(德國布魯克)。

1.2 方法

1.2.1 GAS重組M蛋白多肽疫苗抗原區(qū)段的選擇以及核苷酸引物設(shè)計 根據(jù)前期emm基因測序結(jié)果分析[1，4]，選擇編碼信號肽后 35 個氨基酸(屬于M蛋白的型特異區(qū))的核苷酸序列作為目的基因;同時我們的測序結(jié)果還發(fā)現(xiàn)emm1和emm12 C端保守區(qū)J14肽的核苷酸序列一致，故我們設(shè)計將分別編碼GASM蛋白(emm1和emm12)信號肽后35個氨基酸和 J14肽的核苷酸序列串聯(lián)[5-7]起來(GGTTTTGCGAATCAAACAGAGGTTAAGGCTAACGGTGATGGTAATCCTAGGGAAGTTATAGAAGATCTTGCAGCAAACAATCCCGCAATACAAAATATACGTTTAGATCATAGTGATTTAGTCGCAGAAAAACAACGTTTAGAAGATTTAGGACAAAAATTTGAAAGACTGAAACAGCGTTCAGAACTCTACCTTCAGCAATACTATGATGCATCACGTGAAGCTAAAAAACAAGTTGAAAAAGCTTTAGAA)。根據(jù)Oligo6軟件分析，得出重組基因?qū)儆诔Ｒ?guī)基因序列，平均GC含量為37.04，將此重組基因序列分成6個片段，共合成了12條引物(含有保護性堿基，上海捷瑞生物工程有限公司)，Primer 1和Primer 12分別包含有BamHⅠ/XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點。該段基因序列編碼84個氨基酸(GFANQTEVKANGDGNPREVIEDLAANNPAIQNIRLDHSDLVAEKQRLEDLGQKFERLKQRSELYLQQYYDASREAKKQVEKALE，約9.6 kD)通過和 CDC數(shù)據(jù)庫比對確定和各組織均無任何同源性，具有良好的免疫原性。

1.2.2 核苷酸引物片段 Primer 1:ACTTAGGATCCATGGGTTTTGCGAATCAAACAGAGGTT(含有BamHⅠ酶切位點);Primer 2:GATTACCATCACCGTTAGCCTTAACCTCTGTTTGATTCGCAAAA;Primer 3:AAGGCTAACGGTGATGGTAATCCTAGGGAAGTTATAGAAGATCT;Primer 4:TATTGCGGGATTGTTTGCTGCAAGATCTTCTATAACTTCCCTAG;Primer 5:TGCAGCAAACAATCCCGCAATACAAAATATACGTTTAGATCATAGT;Primer 6:GTTGTTTTTCTGCGACTAAATCACTATGATCTAAACGTAl-TATTTTG;Primer 7:GATTTAGTCGCAGAAAAACAACGTTTAGAAGATTTAGGACAAAAAT;Primer 8:GAACGCTGTTTCAGTCTTTCAAATTTTTGTCCTAAATCTTCTAAAC;Primer 9:TTGAAAGACTGAAACAGCGTTCAGAACTCTACCTTCAGCAATAC;Primer 10:TAGCTTCACGTGATGCATCATAGTATTGCTGAAGGTAGAGTTCT;Primer 11:TATGATGCATCACGTGAAGCTAAAA-AACAAGTTGAAAAAGCTTT;Primer 12:ACTTACTCGAGTTATTCTAAAGCTTTTTCAACTTGTTTTT(含有 XhoⅠ的酶切位點)。

1.2.3 重疊PCR以及原核表達載體構(gòu)建 上述混合引物 5 μl、Primer 1:2 μl、Primer 12:2 μl、Taq 酶1 μl、超純水 13 μl、Buffer 1 μl、dNTP 1 μl，25 μl反應(yīng)體系;反應(yīng)條件:94℃ 20秒;54℃ 20秒;72℃ 12秒，20個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物純化后連入T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，質(zhì)粒測序、挑選正確的單克隆;將測序正確的連入T載體的質(zhì)粒用BamHⅠ/XhoⅠ把270 bp的目的片段切下來;同時用BamHⅠ/XhoⅠ對空質(zhì)粒(pGEX-4T-1，pG)進行酶切;回收需要的片段和酶切后的空載體進行連接，并轉(zhuǎn)化BL21，挑取單克隆培養(yǎng)，然后提質(zhì)粒、酶切鑒定并測序，挑選正確的克隆，構(gòu)建含有目的片段的重組質(zhì)粒(pGEX-4T-1-emm1-12-J14，pE)的大腸桿菌BL21菌株(pE/B)。

1.2.4 GST融合蛋白(GST/emm)誘導(dǎo)表達

1.2.4.1 GST/emm基礎(chǔ)表達 將BL21轉(zhuǎn)接至無氨芐抗性的LB平板上，同時分別將pG/B(轉(zhuǎn)化了空質(zhì)粒pG的大腸桿菌BL21)和pE/B(轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pE的大腸桿菌BL21)菌株轉(zhuǎn)接至氨芐抗性的LB平板上;37℃培養(yǎng)過夜后各挑取單克隆菌落到1 ml LB培養(yǎng)基中(Amp 100 μg/ml)，過夜振蕩培養(yǎng)(12～16小時，180～200 r/min，37℃)后以1∶100比例將菌液轉(zhuǎn)接于2 ml LB培養(yǎng)基中(Amp 100 μg/ml)，劇烈振蕩培養(yǎng)2小時(220 r/min，37℃，OD 值約0.6～0.8，下同)。取出1 ml菌液不加IPTG，作為陰性對照;另外1 ml加入終濃度為1 mmol/L的IPTG 25℃誘導(dǎo) 2小時后，收集菌液離心(4℃，12 000 r/min，5分鐘)、棄上清，細菌沉淀重懸于100 μl 1×SDS上樣緩沖液中(使用前加入終濃度為0.1 mmol/L的DTT);冰上超聲裂解，3秒×3～5次;短暫高速離心后100℃水浴5分鐘;4℃，12 000 r/min，5分鐘離心，冰上放置，等全部樣品處理完后一起進行12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(200 V，40分鐘)、考馬斯亮藍染色40分鐘和脫色后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照;并進一步通過Western blot檢測GST融合蛋白表達(下同)。

1.2.4.2 IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達的時效性 分別取適量上述振蕩培養(yǎng)過夜的pG/B和pE/B菌液，按照1∶100轉(zhuǎn)接于所需要的LB培養(yǎng)基中(Amp 100 μg/ml)，劇烈振蕩培養(yǎng)2 小時(220 r/min，37℃，OD值約0.6～0.8)后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG 25℃分別誘導(dǎo)0、2、6、8、18 和24 小時(pG/B 只做未誘導(dǎo)和2小時誘導(dǎo)組)，其余處理同上。

1.2.4.3 不同濃度的IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達在上述步驟中，分別加入終濃度為 0.01、0.1、1 mmol/L的IPTG在25℃誘導(dǎo)8小時，其余同上(pG/B只做未誘導(dǎo)和1 mmol/L誘導(dǎo)組)。

1.2.4.4 不同溫度下IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達在不同溫度 (25℃、30℃、37℃)，以終濃度為1 mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)8小時，其余步驟同上，將聚丙烯酰胺凝膠上的目的條帶(35.6 kD)切下進行蛋白質(zhì)譜分析(由中山大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)實驗室完成)。

1.2.5 Western blot檢測GST/emm的表達 IPTG誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組(只做上述的基礎(chǔ)表達組和pE/B的時間組與濃度組)取1 ml菌液如上處理，每條泳道上樣量為20 μg(約25 μl上述細菌裂解液)。進行12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后經(jīng)半干電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(100 V、60分鐘)，在室溫下用封閉緩沖液(5%脫脂奶粉，含0.1%TWEEN20的 TBS配制)封閉1小時，洗膜、兔抗GST單克隆抗體為一抗(1∶2 000稀釋)4℃孵育過夜、洗膜后與 HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG，二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1小時，洗膜后增強化學(xué)發(fā)光法顯色，X線底片曝光1分鐘顯影，并進行灰度掃描。

1.2.6 質(zhì)譜分析檢測融合蛋白GST/emm 用刀片切取1～2 mm膠粒，置于1.5 ml EP管中、清洗(用200 μl MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘)、脫色(對于考染膠，加25 mmol/L NH4HCO3和50%ACN考染脫色液200 μl、37℃、20分鐘或超聲脫色5分鐘、吸干;重復(fù)脫色2～3次，至藍色褪去)、脫水(加ACN 100 μl脫水至膠粒變白，吸棄 ACN);加10 mmol/L DTT 50 μl，37℃1 小時;冷至室溫，快速加IAA 30 mmol/L 50 μl，置于暗室 45 分鐘;清洗:用200 μl MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘;然后用200 μl 50%ACN震蕩清洗2次，每次10分鐘;脫水:加ACN 100 μl脫水至膠粒變白，吸棄ACN;用25 mmol/L NH4HCO3稀釋 Trypsin 至12.5 mg/ml，每管加10 μl，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4℃放置30分鐘 ，待酶液被膠粒完全吸收，吸棄多余的酶液，加 25 mmol/L NH4HCO315 μl，37℃過夜(16小時)。然后AnchorChip靶點樣。最后進行質(zhì)譜分析以上制備的樣品，使用德國Bruker公司的UltraflexⅢ質(zhì)譜儀進行分析。所獲得圖譜使用Biotools軟件檢索，以 MASCOT(Matrix Science，London，UK)為搜索引擎。搜索參數(shù)設(shè)置:數(shù)據(jù)庫為自建序列數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)檢索的方式為combined;最大允許漏切位點為1;酶為胰蛋白酶。質(zhì)量誤差范圍設(shè)置:PMF50ppm，MS/MS0.5Da。

2 結(jié)果

2.1 Overlap-PCR結(jié)果 如圖1所示，通過Overlap-PCR合成的重組DNA目的序列接近272 bp，通過瓊脂糖凝膠回收、純化并測序(上海捷瑞生物工程有限公司完成)，結(jié)果與設(shè)計之初的序列完全符合，可以用于下一步的表達載體構(gòu)建。如圖2所示用BamHⅠ和XhoⅠ快速型限制性內(nèi)切酶雙酶切空質(zhì)粒(pG)和重組質(zhì)粒(pE)，后者可見目的片段約252 bp，并將pE測序鑒定，重組核苷酸序列的編碼框正確，編碼84個氨基酸。

2.2 成功構(gòu)建含目的片段的pGEX-4T-1-emm1-12-J14(pE)重組質(zhì)粒 圖3為我們所構(gòu)建的含目的DNA的表達載體結(jié)構(gòu)示意圖，我們選擇了高效的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S transferase，GST)標(biāo)記的融合蛋白表達系統(tǒng)(pGEX-4T-1，pG)，該質(zhì)粒作為空質(zhì)粒與所克隆的目的片段進行連接轉(zhuǎn)化，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達重組質(zhì)粒pE的大腸桿菌BL21菌株。

2.3 GST/emm誘導(dǎo)表達

圖1 Overlap PCR電泳圖Fig．1 1．5%Agarose gel electrophoretic profiles of recombinant emm gene amplified by Overlap PCR

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切1．5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig．2 1．5%Agarose gel electrophoretic profiles of recombinant plasmid cleavage with Bam HⅠ/XhoⅠ

2.3.1 GST/emm基礎(chǔ)表達 如圖4所示，E.coli BL21無論誘導(dǎo)與否均無GST(26 kD)和GST融合蛋白(GST/emm，約35.6 kD)表達;表達空質(zhì)粒(pG)的BL21未誘導(dǎo)時無GST表達;而轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒(pGEX-4T-1-emm1-12-J14，pE)的 BL21無GST/emm表達，誘導(dǎo)后GST/emm明顯過量表達。

2.3.2 IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達的時效性 如圖5所示，1 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)表達重組質(zhì)粒的BL21(pE/B)0、2、6、8、18、24 小時后，GST 融合蛋白(GST/emm)的表達在2小時就比較明顯，在6～8小時達高峰，18小時和24小時時有所下降，但依舊是過量表達。

圖3 pGEX-4T-1/emm1-12-J14結(jié)構(gòu)示意圖Fig．3 The structure diagram of pGEX-4T-1/emm1-12-J14

圖4 IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白在E．coli BL21中的表達Fig．4 The expression of inducible protein with IPTG

表1 GST/emm質(zhì)譜分析結(jié)果Tab．1 The fusion protein(GST/emm)examined with MALDI-TOF MS

圖5 IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達的時間效應(yīng)Fig．5 The expression of GST/emm induced with IPTG at different times

圖6 IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達的濃度效應(yīng)Fig．6 The expression of GST/emm induced with different concentrations of IPTG

2.3.3 不同濃度和溫度下IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白的表達 如圖6所示，12%SDS-PAGE和Western blot結(jié)果均表明不同濃度的 IPTG(0.01、0.1、1 mmol/L)誘導(dǎo)pE/B 8小時時表達GST/emm融合蛋白在較低濃度時即有明顯表達，隨濃度增加表達有所增加。1 mmol/L IPTG在不同溫度下誘導(dǎo)GST/emm表達均為過量表達，溫度對融合蛋白表達量的影響不明顯，見圖7。

圖7 溫度對IPTG誘導(dǎo)GST/emm表達Fig．7 The expression of GST/induced with IPTG under different tempreatures

圖8 GST/emm質(zhì)譜檢測結(jié)果Fig．8 The fusion protein(GST/emm)examined with MALDI-TOF MS

2.4 GST/emm質(zhì)譜檢測結(jié)果 如表1和圖8所示:蛋白質(zhì)譜分析gi|21305379(自建數(shù)據(jù)庫)是以重組蛋白的氨基酸序列(如前所述，M蛋白信號肽后的35個氨基酸和J14肽序列串聯(lián))建立數(shù)據(jù)庫，GST/emm質(zhì)譜分析結(jié)果與該數(shù)據(jù)庫比對，如果分?jǐn)?shù)超過16分即可確定誘導(dǎo)的融合蛋白正確，蛋白質(zhì)譜分析確定35.6 kD處的條帶是GST/emm，可以進行下一步實驗。

3 討論

眾所周知GAS可以引發(fā)多種感染性和感染后自身免疫性疾病，尤其在發(fā)展中國家由其導(dǎo)致的風(fēng)濕熱以及風(fēng)濕性心臟病仍有較高的發(fā)病率和致殘致死率，所以近年來各國學(xué)者一直致力于針對GAS的疫苗研制[4，7]。由 emm 基因編碼的 M 蛋白作為GAS最重要的毒力因子之一是熱門的候選免疫原。目前歐美國家已經(jīng)成功構(gòu)建針對M蛋白的多價疫苗并進行了臨床試驗[5-8]。但是各個地區(qū)和國家致病型GAS的流行情況不同，編碼其主要毒力因子M蛋白的emm基因分型也不盡相同，這就需要不同國家或者地區(qū)進行相關(guān)GAS及其emm分型的流行病學(xué)調(diào)查以便選出適合本國的針對M蛋白的疫苗候選基因，這一項工作我們在前期已經(jīng)完成[1]。

我們之所以選擇編碼M蛋白信號肽后35個氨基酸的核苷酸序列作為目的基因，是因為此區(qū)為GAS M蛋白型特異性的高變區(qū)，且信號肽后的這部分序列與人的組織無交叉免疫反應(yīng)，通常把該區(qū)編碼的多肽序列作為候選疫苗。我們的測序結(jié)果還發(fā)現(xiàn)emm1和emm12 C端保守區(qū)J14肽的核苷酸序列一致，現(xiàn)在的動物實驗已經(jīng)證明了GAS不同亞型的C端保守區(qū)編碼的J14或J8肽具有很好的免疫原性，是保護性抗原，它們可以刺激動物產(chǎn)生保護性抗體[2，6]。故通過分子克隆技術(shù)將致咽炎GAS的2型emm(1和12)編碼信號肽后35個氨基酸的基因與j14肽的基因串聯(lián)起來，由其編碼的重組蛋白在NCBI與人的對該氨基酸序列比對無任何同源性，可作為很好的疫苗候選者。重疊PCR是根據(jù)目的基因的核苷酸序列，將目的基因分成70～90 bp不等的多條引物，分段進行合成;利用相連片段間20～30 bp重疊的核苷酸部分互相搭橋、互為模板，通過幾輪連續(xù)的PCR反應(yīng)將各片段粘合在一起，組合成為目的基因。該技術(shù)的關(guān)鍵在于核苷酸引物的設(shè)計、退火溫度的控制以及首尾重疊部分(一般需要25 bp)。我們通過引物設(shè)計軟件，將目的基因分成6個片段、共設(shè)計了12條引物，同時引入相應(yīng)的酶切位點(見方法與結(jié)果)，成功合成了編碼候選多肽的全基因序列;并進一步構(gòu)建了GST標(biāo)簽的重組質(zhì)粒、成功轉(zhuǎn)化E.coli BL21、建立了穩(wěn)定表達目的基因的大腸桿菌株系。

GST標(biāo)簽的融合蛋白表達載體業(yè)已成熟尤其在融合蛋白的可溶性表達以及維持蛋白表達后的生物活性上有其獨到之處。我們選擇帶有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1作為表達載體，將重組的DNA目的片段克隆到該載體上，構(gòu)建了穩(wěn)定表達體系。該質(zhì)粒含有凝血酶專一酶切位點，為大量誘導(dǎo)表達和純化融合蛋白以及切去GST標(biāo)簽，獲得目的蛋白或多肽提供了很大的可能性。我們利用構(gòu)建好的含有編碼M蛋白目的基因的重組質(zhì)粒，成功通過IPTG誘導(dǎo)了GST融合蛋白的過量表達，摸索出最佳表達條件。誘導(dǎo)結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE、Western blot以及蛋白質(zhì)譜分析目的條帶均正確，其中質(zhì)譜分析是目前較為先進的檢測多肽片段的蛋白質(zhì)實驗技術(shù)。該技術(shù)是一種新型的檢測多肽或蛋白質(zhì)的方法，尤其是在沒有成熟的單克隆抗體或檢測小分子多肽時[9]，其原理是:通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。我們的研究中利用所設(shè)計的重組多肽氨基酸序列自建數(shù)據(jù)庫，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析目的多肽或融合蛋白，結(jié)果表明GST/emm中多肽分子量和氨基酸正確，與自建數(shù)據(jù)庫相匹配。這就為下一步候選免疫原蛋白的大量表達純化、酶切以及下游的動物實驗奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 丁月霞，倪瓊瓊，劉金來.廣州市兒童致咽炎β溶血性鏈球菌的流行情況及其emm基因分型[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2011;32(3):411-415.

2 Dale J B.Multivalent group A streptococcal vaccine designed to optimize the immunogenicity of six tandem M protein fragments[J].Vaccine，1999;17(2):193-200.

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9 陳紹農(nóng)，潘遠江，陳耀祖.多肽及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析新進展[J].質(zhì)譜學(xué)報，1995;16(3):15-21.