吲哚胺2，3雙加氧酶促進(jìn)血管形成的體外實(shí)驗(yàn)研究①

魏麗娟 于津浦 賈志龍 李 慧 劉俊田 任秀寶 (天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院預(yù)防醫(yī)學(xué)中心天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300060)

吲哚胺2，3雙加氧酶(IDO)是肝臟以外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中表達(dá)IDO，并誘導(dǎo)局部免疫抑制引起患者預(yù)后不良[1-4]。本課題組前期工作中發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織局部高表達(dá)IDO，并且可以誘導(dǎo)局部T細(xì)胞的活化[5]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)局部表達(dá)的IDO和CD105標(biāo)記的微血管密度相關(guān)[6]。本研究旨在通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察IDO對HUVEC細(xì)胞形成管樣結(jié)構(gòu)的能力影響，為進(jìn)一步研究IDO促進(jìn)血管形成的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435S、MDA-MB-453、SK-Br-3、T47D、ZR-75-1、MCF-7及HUVEC細(xì)胞系均由天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院免疫室提供，MDA-MB-435S細(xì)胞在含10%FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃條件下單層貼壁培養(yǎng);其余細(xì)胞在含10%FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃條件下單層貼壁培養(yǎng)。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測IDOmRNA的水平 TRIZoL試劑(Gibco公司)一步法提取總RNA、紫外分光光度計(jì)測純度與濃度。IDO和β-actin引物均由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。采用SuperscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT反應(yīng)，總體系20 μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5分鐘;94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán);72℃完全延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物加入1%瓊脂糖凝膠中，在0.5×TBE中進(jìn)行電泳，紫外光下拍照記錄。

1.3 氨基酸分析儀檢測IDO活性 收集培養(yǎng)72小時(shí)后且生長狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞上清。取2 ml樣品加入磺基水楊酸0.1 g，4℃ 18 000 r/min離心30分鐘，取上清液。測定條件:儀器為日立L-8800型全自動氨基酸分析儀;分離柱徑為4.6 mm×60 mm，離子交換樹脂 2622 SC型;緩沖液泵壓力6.90～7.90 kpa，流速 4.0 ml/min，茚三酮泵壓力0.89～1.00 kpa，流速 3.5 ml/min;分離柱柱溫57℃，反應(yīng)柱柱溫134℃。上機(jī)檢測培養(yǎng)上清中游離氨基酸含量。

1.4 共培養(yǎng)體系的建立 取對數(shù)生長期的MCF-7和HUVEC細(xì)胞離心，調(diào)整HUVEC細(xì)胞濃度為1×105ml-1，調(diào)整MCF-7濃度至5×104ml-1。取1.5 ml HUVEC細(xì)胞接種于共培養(yǎng)模型的下室，上室分別接種0.5 ml的HUVEC，MCF-7和MCF-7細(xì)胞共三組，最后一組的培養(yǎng)液中含1-MT(終濃度為1 mmol/L)。取24、48、72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式檢測。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測CD105表達(dá) 將收集制備好的單細(xì)胞懸液置于Eppendorf管中，每管5×105個(gè)細(xì)胞，12 000 r/min離心3分鐘，棄上清，體系定為20 μl，混勻。每管加入 anti-105-FITC 10 μl，對照管中加入 anti-IgG2α-FITC 10 μl。充分混勻后4℃避光孵育40分鐘。PBS緩沖液洗滌，100 μl 1%多聚甲醛固定，上機(jī)檢測。

表1 人IDO和β-actin的引物序列和擴(kuò)增長度Tab．1 The primer and amplification length of IDO and βactin

1.6 基質(zhì)膠(Matrigel)成管實(shí)驗(yàn) 取預(yù)冷的基質(zhì)膠50 μl/孔均勻涂布96孔平板，置于37℃孵箱中30分鐘，將制備好的不同狀態(tài)的HUVEC接種于基質(zhì)膠表面，培養(yǎng)6小時(shí)起不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞間連接形成的中空管樣結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，規(guī)定雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞系中IDO基因的表達(dá) 人乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231、MDA-MB-435S、MDA-MB-453、SK-Br-3、MCF-7、T47D、ZR-75-1，半定量 RT-PCR 法檢測IDO基因的表達(dá)情況如下:IDO表達(dá)細(xì)胞系為MDA-MB-435S、T47D、MCF-7;在 MDA-MB-231、MDA-MB-453、SK-Br-3、ZR-75-1 各細(xì)胞系中亦有IDO表達(dá)(圖1)。

2.2 MCF-7細(xì)胞中IDO蛋白的表達(dá)活性 培養(yǎng)上清中可檢測到(8.12±1.01)mg/L的犬尿氨酸，而色氨酸未檢出(＜3 pmol)，表明MCF-7細(xì)胞中IDO的表達(dá)可以降解色氨酸，具有功能活性(圖2)。

2.3 IDO對HUVEC增殖的影響 以1×105ml-1的HUVEC種植于Transwell小室下層記為第1天，取第2、3、4天時(shí)間點(diǎn)，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，繪制細(xì)胞生長曲線(圖3)。共培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)與MCF-7共培養(yǎng)后的HUVEC與另兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。繼續(xù)共培養(yǎng)48和72小時(shí)后，均數(shù)間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 細(xì)胞系中IDO陰性及陽性表達(dá)的篩選Fig．1 Analysis of IDO expression in different cell lines by agarose gel electrophoresis

2.4 流式細(xì)胞儀檢測CD105表達(dá) 共培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)組間均數(shù)比較:各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。繼續(xù)共培養(yǎng)48、72小時(shí)后，組間均數(shù)比較與24小時(shí)情況一致。組內(nèi)均數(shù)比較:三組內(nèi)24、48、72小時(shí)時(shí)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.05(圖4、表2)。

圖2 氨基酸分析儀檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清中游離氨基酸Fig．2 Free amino acid in culture supernatant

2.5 IDO對HUVEC成管能力的影響 將三種不同處理方式的HUVEC分別平鋪于基質(zhì)膠，并連續(xù)觀察其所形成的中空管樣結(jié)構(gòu)數(shù)目及形態(tài)。HUVEC在6小時(shí)時(shí)即有管樣結(jié)構(gòu)形成，并逐漸增多，至24小時(shí)形成的管樣結(jié)構(gòu)數(shù)目最多，48小時(shí)后管樣結(jié)構(gòu)逐漸減少。與MCF-7共培養(yǎng)后的HUVEC管樣結(jié)構(gòu)數(shù)目較多，HUVEC細(xì)胞多呈復(fù)層排列。培養(yǎng)液中加入1-MT，與MCF-7共培養(yǎng)后的HUVEC幾乎無管樣結(jié)構(gòu)存在(圖5、表3)。

圖3 IDO對HUVEC增殖的作用Fig．3 Evaluated the effects of IDO on proliferation of HUVEC

圖4 不同共培養(yǎng)體系中HUVEC細(xì)胞CD105的表達(dá)率Fig．4 Evaluation of the CD105 expression in HUVEC by flow-cytometry analysis in different co-culture systems

表2 不同共培養(yǎng)體系中HUVEC-CD105表達(dá)率(±s)Tab．2 The CD105 expression in HUVEC in co-culture system(±s)

表2 不同共培養(yǎng)體系中HUVEC-CD105表達(dá)率(±s)Tab．2 The CD105 expression in HUVEC in co-culture system(±s)

HUVEC HUVEC(+MCF-7)HUVEC(+MCF-7+1-MT)24 h 5.90±0.97 16.91±1.12 9.16±0.38 48 h 13.53±1.33 45.13±6.32 21.99±3.06 72 h 7.99±0.52 27.30±1.83 19.80±1.05

表3 不同體系共培養(yǎng)后HUVEC細(xì)胞形成管樣結(jié)構(gòu)數(shù)目[(±s)/×40]Tab．3 The number of vessel-like structures in different co-culture systems[(±s)/×40]

表3 不同體系共培養(yǎng)后HUVEC細(xì)胞形成管樣結(jié)構(gòu)數(shù)目[(±s)/×40]Tab．3 The number of vessel-like structures in different co-culture systems[(±s)/×40]

HUVEC HUVEC(+MCF-7)HUVEC(+MCF-7+1-MT)6 h 4.33±1.00 14.00±1.22 1.00±0.87 12 h 6.00±0.86 16.67±1.12 1.33±0.71 24 h 7.44±1.42 19.67±2.00 2.00±0.71 36 h 4.22±0.67 17.56±1.42 1.22±0.67 48 h 3.56±0.88 15.22±1.2 0.67±0.71 72 h 2.67±0.71 12.33±1.22 0.44±0.72

3 討論

IDO作為肝外色氨酸代謝過程中的限速酶，與自身免疫、移植免疫及母胎耐受等多種發(fā)病機(jī)制相關(guān)。Uyttenhove等[7]首先發(fā)現(xiàn)，大部分人腫瘤細(xì)胞高表達(dá)IDO，并且多數(shù)研究認(rèn)為IDO高表達(dá)是獨(dú)立的不良預(yù)后指標(biāo)[1-4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中IDO的表達(dá)和腫瘤局部Treg細(xì)胞的分布密切相關(guān)，兩者共同參與腫瘤的局部免疫耐受而加速腫瘤進(jìn)展[5]。目前關(guān)于IDO與腫瘤的相關(guān)研究主要集中在腫瘤免疫耐受方面，IDO與重力血管形成相關(guān)的報(bào)道較少。Hiroaki[8]在研究IDO與卵巢癌疾病進(jìn)展的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)IDO通過抑制腫瘤局部NK細(xì)胞的增殖和促進(jìn)血管形成加速卵巢癌的進(jìn)展，該研究利用基因轉(zhuǎn)染的方式獲得表達(dá)IDO的卵巢癌細(xì)胞系OMC-1/IDO，體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IDO可以促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，同時(shí)免疫組化結(jié)果顯示OMC-1/IDO腫瘤組織中每高倍視野平均有(8±1)個(gè)新生血管而OMC-1腫瘤組織中僅為(3±1)個(gè)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本課題組前期工作中發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織局部高表達(dá)IDO且與CD105標(biāo)記的微血管密度成正相關(guān)[6]，本研究旨在通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察IDO對HUVEC細(xì)胞成管能力的影響，為進(jìn)一步研究IDO促進(jìn)血管形成的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，從而為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的思路。

CD105是一種增殖相關(guān)蛋白，與CD31、CD34等泛內(nèi)皮標(biāo)志物相比，CD105能更準(zhǔn)確地反映內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。Charpin等[9]對360例乳腺癌石蠟標(biāo)本進(jìn)行了CD31、CD105的檢測，經(jīng)過14.3年的隨訪發(fā)現(xiàn)，CD105與患者總生存和無轉(zhuǎn)移生存顯著相關(guān)，而CD31與患者預(yù)后無關(guān)。Kumar等[10]采用抗CD105抗體觀察了106例乳腺癌組織中微血管密度與病人預(yù)后的相關(guān)性，多因素分析顯示用CD105測定微血管密度值是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。我們利用流式細(xì)胞儀檢測了 HUVEC表面CD105的表達(dá)情況，與MCF-7共培養(yǎng)后HUVEC表面CD105的表達(dá)率較獨(dú)立培養(yǎng)的HUVEC表達(dá)率更高，但是在共培養(yǎng)中加入IDO抑制劑1-MT后，HUVEC的增殖以及其表面CD105的表達(dá)率均受到抑制，這提示我們IDO在HUVEC的增殖以及活化中發(fā)揮了一定的作用?；|(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤細(xì)胞可以明顯促進(jìn)HUVEC細(xì)胞間的細(xì)胞連接增多，管樣結(jié)構(gòu)形成增多，加入1-MT后，管樣結(jié)構(gòu)減少，進(jìn)一步驗(yàn)證了IDO可以加速新生血管形成。

本實(shí)驗(yàn)中我們利用Transwell小室共培養(yǎng)模型，觀察到體外環(huán)境中IDO能夠提高HUVEC成管能力，但是其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。Li等[11]的研究發(fā)現(xiàn)在異種移植皮膚內(nèi)IDO能夠誘導(dǎo)血管形成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染高表達(dá)IDO的成纖維細(xì)胞移植片的傷口毛細(xì)血管樣管腔的數(shù)量在第8天會明顯增加。該研究認(rèn)為其機(jī)制與色氨酸代謝產(chǎn)生的犬尿氨酸引起的毒性反應(yīng)無關(guān)，而與色氨酸缺乏有關(guān)，環(huán)境中的色氨酸缺乏作為刺激因子引起了一系列的反應(yīng)從而促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、活化，形成毛細(xì)血管。我們的研究證實(shí)IDO可以促進(jìn)HUVEC形成管樣結(jié)構(gòu)，其機(jī)制可能與色氨酸缺乏有關(guān)，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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7 Uyttenhove C，Pilotte L，Theate I et al.Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2，3-dioxygenase[J].Nat Med，2003;9(10):1269-1274.

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