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    Poly(I:C)影響間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化及其對樹突狀細(xì)胞的作用①

    2013-11-27 11:15:30趙曉寅侯亞義南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與生殖生物學(xué)實驗室南京210093
    中國免疫學(xué)雜志 2013年1期
    關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)成骨臍帶

    趙曉寅 劉 丹 劉 柳 侯亞義 (南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與生殖生物學(xué)實驗室,南京210093)

    間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞,能夠分化形成脂肪、骨和軟骨等組織,除了具備多向分化潛能,MSC還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力[1]。同時,取材的廣泛方便、體外擴(kuò)增操作的簡單迅速及其可塑性使得MSC在臨床治療中有廣闊的應(yīng)用前景。作為臨床應(yīng)用的希望,MSC治療的相關(guān)研究已經(jīng)在許多不同的疾病動物模型中展開,包括異體免疫排斥、器官和干細(xì)胞移植、自身免疫和腫瘤免疫等。

    免疫細(xì)胞外源性和內(nèi)源性表達(dá)的Toll樣受體(TLR)對其在天然免疫和獲得性免疫中抵抗入侵者起到十分關(guān)鍵的作用[2,3]。到目前為止,在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)的TLR有13個(人類10個和小鼠13個)。TLR能夠識別細(xì)菌、病毒、真菌等多種病原相關(guān)分子模式及某些由宿主產(chǎn)生的分子[4]。TLR能夠被他們特異的配體或激動劑活化,從而引起MyD88依賴的或TRIF依賴的下游信號分子的激活。這些信號通路的激活觸發(fā)了下游各種細(xì)胞因子、趨化因子和其他炎癥介質(zhì)的分泌[5]。

    近年來的研究發(fā)現(xiàn),骨髓、脂肪和臍帶來源的MSC都能夠表達(dá)TLR,TLR信號的活化對MSC的分化、增殖和免疫調(diào)節(jié)功能的影響依然存在爭議[6-15]。因此,本研究分析了TLR3配體——Poly(I:C)對臍帶MSC表型、細(xì)胞增殖、凋亡、成骨分化以及免疫調(diào)節(jié)功能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料 臍帶取自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科,正常足月妊娠剖宮產(chǎn)胎兒的臍帶。所用材料均嚴(yán)格遵守醫(yī)學(xué)倫理道德,經(jīng)產(chǎn)婦及家屬認(rèn)可,并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和優(yōu)級胎牛血清(Gibco公司);膠原酶 Ⅱ、中性蛋白酶和透明質(zhì)酸酶(Sigma公司);小鼠抗人 PE-CD117、PE-CD44、PE-CD29、FITC-CD31、FITC-CD45和APC-CD105單克隆抗體(ebioscience公司);rmGM-CSF、rmIL-4(Miltenyi Biotec 公司);兔抗小鼠 PE-CD11c、Alexa Flour-CD11c、FITC-CD80、FITC-CD86和APC-MHC-Ⅱ單克隆抗體(ebioscience公司)。

    1.2 人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) MSC分離及純化按本實驗室常規(guī)方法。從手術(shù)室取足月剖腹產(chǎn)的胎兒臍帶,在無菌狀態(tài)下用預(yù)冷的含0.01%青霉素和鏈霉素的PBS沖洗,去掉臍帶內(nèi)血塊。在DMEM/F12基本培養(yǎng)基中,將臍動脈剝除,其余部分剪成2 mm3碎塊,加入250 U/ml的膠原酶Ⅱ,100 U/ml中性蛋白酶,10 U/ml透明質(zhì)酸酶,37℃振蕩消化3小時至組織基本消化完全,離心去上清,洗3次,培養(yǎng)于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中(含10%FBS)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×109L-1于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃恒溫,5%CO2),3~4天后,輕輕晃動培養(yǎng)板,全量換液,待細(xì)胞豐度達(dá)80%左右時,用2.5 g/L的胰酶消化、傳代。取第3~8代細(xì)胞,分析其表面標(biāo)志,確定其為MSC后用于后續(xù)試驗。

    1.3 小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 4~6周的C57BL/6小鼠購自揚州大學(xué)比較動物中心,所有的小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實驗。DC細(xì)胞來源于小鼠的骨髓。將C57BL/6小鼠斷頸處死,在無菌條件下取出脛骨和腓骨,置于無菌PBS中待用;使用注射器吸取PBS,反復(fù)沖洗骨髓腔,直至骨發(fā)白;將骨髓懸液用100目篩網(wǎng)過濾并收集到離心管中。4℃,1 200 r/min離心5分鐘,棄上清,加入紅細(xì)胞裂解液,靜置2分鐘后加入 PBS稀釋,4℃,1 200 r/min離心5分鐘,棄上清,加入 PBS混勻,4℃,1200 r/min離心5分鐘后,收集沉淀的骨髓細(xì)胞。將收集的小鼠骨髓細(xì)胞重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/ml,接種于12孔板中,每孔加入1 ml RPMI1640完全培養(yǎng)基(添加10%FCS胎牛血清,100 μg/ml的青霉素,100 μg/ml的鏈霉素,10 ng/ml的GM-CSF,1 ng/ml IL-4)。所有細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下貼壁培養(yǎng);第三天、第五天半量換液,移除不貼壁的細(xì)胞;培養(yǎng)至第六天,通過流式細(xì)胞儀鑒定,>90%的細(xì)胞均為CD11c陽性。

    1.4 流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志

    1.4.1 MSC表面標(biāo)志的檢測 胰酶消化細(xì)胞,PBS洗兩遍,4℃,1 200 r/min,離心5分鐘,棄上清;調(diào)整細(xì)胞密度約每管(1~5)×105個細(xì)胞。共三例臍帶MSC,每個標(biāo)記設(shè)三復(fù)孔,按照抗體說明書的用量加入同型對照和相應(yīng)抗體,4℃避光孵育30分鐘,PBS洗三次后,4℃,1 200 r/min,離心5分鐘;用300 μl的PBS充分重懸細(xì)胞,最后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測分析。MSC 檢測標(biāo)志為:CD117、CD29、CD31、CD44、CD105及CD45。

    1.4.2 DC表面共刺激分子的檢測 將骨髓單核細(xì)胞(5×105cells/孔)與MSC(5×104cells/孔) 于RPMI1640中(添加10%FCS胎牛血清,100 μg/ml的青霉素,100 μg/ml的鏈霉素,1 ng/ml IL-4,10 ng/ml GM-CSF)共培養(yǎng)6天,這時單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為未成熟的DC。向共培養(yǎng)體系中加入10 μg/ml的Poly(I:C)刺激24小時。由于MSC具有很強(qiáng)的貼壁性,而DC為半貼壁細(xì)胞,根據(jù)DC與MSC不同的貼壁特性,將DC于共培養(yǎng)體系中輕輕吹下回收,流式細(xì)胞儀檢測了DC細(xì)胞表面CD86、CD40和MHCⅡ的表達(dá)情況。

    1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 CCK-8法是一種基于 WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽]的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測方法。將3~10代的MSC以104cells/孔的密度接種于48孔板中,細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基中(含10%的FBS,100 μg/ml的青霉素,100 μg/ml的鏈霉素)。分別加入1、10、25 和50 μg/ml的 Poly(I:C)處理24小時和48小時,CCK-8檢測細(xì)胞增殖。

    1.6 Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 壞死細(xì)胞的Annexin V和PI呈雙陽性,而凋亡細(xì)胞為Annexin V陽性,PI陰性,未凋亡細(xì)胞Annexin V和PI皆呈陰性。操作步驟:分別加入 1、10、25和50 μg/ml的Poly(I:C)處理MSC 24小時和48小時后,用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化,收集細(xì)胞于流式管中;PBS洗兩遍,200 μl binding buffer復(fù)懸(約細(xì)胞 106個/ml),加入 2.5 μl Annexin V-FITC;混勻,室溫避光作用10分鐘;加入10 μl 25 μg/ml的PI,避光作用10分鐘;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

    1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測DC吞噬能力 將處理后的DC輕輕吹下培養(yǎng)于24孔板中,加入0.2 mg/ml的FITC-dextran(右旋糖酐),于 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60分鐘,另設(shè)4℃孵育作為對照。PBS洗3次后,每管加入300 μl的1.2 mg/ml臺盼藍(lán)重懸細(xì)胞,以淬滅胞外熒光。流式細(xì)胞儀檢測FITC-dextran陽性細(xì)胞百分比。

    1.8 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

    1.8.1 小鼠淋巴結(jié)T細(xì)胞的獲取 將BALB/c小鼠斷頸處死,無菌條件下取腋下及腸系膜淋巴結(jié)置于預(yù)冷無菌的RPMI1640培養(yǎng)基中,除去多余的脂肪組織;用注射器針芯將淋巴結(jié)細(xì)胞輕輕擠出;加入5 ml培養(yǎng)基,反復(fù)吹打至細(xì)胞懸液均勻后,篩網(wǎng)過濾,收集細(xì)胞懸液,離心,棄上清,培養(yǎng)基洗一遍后,計數(shù)待用。

    1.8.2 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) DC分為Control組、Poly(I:C)刺激組、MSC共培養(yǎng)+Poly(I:C)刺激組

    (MSC∶DC=1∶10或1∶20)。將T細(xì)胞用 CFSE 標(biāo)記后鋪于96孔板中,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106ml-1,每孔加入100 μl T細(xì)胞后,各處理組的DC與T細(xì)胞按1∶10的比例加入培養(yǎng)體系中,終體積為200 μl/孔,每組設(shè)4個復(fù)孔。置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)三天后,流式檢測T細(xì)胞增殖情況。

    1.9 茜素紅S染色 茜素紅染色的原理是基于沉積的鈣可以與茜素紅發(fā)生顯色反應(yīng)并在細(xì)胞外基質(zhì)中被染成橘紅色。將培養(yǎng)板用PBS洗2次,95%的乙醇固定10分鐘,雙蒸水沖洗3次;0.1%茜素紅-Tris-HCl(pH8.3)37℃染色30分鐘;蒸餾水沖洗后顯微鏡下觀察。

    1.10 Q-PCR檢測mRNA表達(dá) 用Trizol試劑提取MSC中總的RNA,檢測RNA濃度及純度后,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系(20 μl):1 μg RNA,4 μl 5 × RT buffer,2 μl dNTP,0.5 μl RNase inhibitor,0.5 μl Oligo dT,0.5 μl ReverTra Ace,加 DEPC 水至 20 μl;反應(yīng)程序:42℃ 20分鐘,99℃ 5分鐘,4℃ 5分鐘。反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA進(jìn)行隨后的Q-PCR。Q-PCR反應(yīng)體系(10 μl)為:1 μl cDNA(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按1∶10稀釋),0.5 μl上游引物,0.5 μl下游引物,5 μl 2 ×TransStart SYBR Green QPCR Supermix,3 μl ddH2O。Q-PCR反應(yīng)程序:95℃ 10分鐘;95℃ 15秒,60℃ 30秒,72℃ 30秒(40個循環(huán),72℃收集信號);95℃ 15秒,60℃ 30秒,95℃ 15秒(1個循環(huán),熔解曲線)。反應(yīng)在ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀中進(jìn)行,得到各個基因的Ct值,使用2-ΔΔCt方法分析目的基因表達(dá),以GAPDH作為內(nèi)參。每實驗組設(shè)置3個重復(fù),每個樣本設(shè)置三個復(fù)孔。所用基因的引物由Invitrogen合成,引物序列如表1。

    1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)三次以上,結(jié)果以±s表示,使用 Prism 5(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并作圖。One-way ANOVA analysis用來分析3組及以上數(shù)據(jù)的差異。P<0.05時,差異具有顯著性。

    表1 mRNA上下游引物序列Tab.1 The primer sequences used in PCR

    2 結(jié)果

    2.1 Poly(I:C)不改變MSC的表型 取第3~8代的MSC,以105個/孔的密度接種于6孔板中,Poly(I:C)刺激48小時后,流式細(xì)胞儀檢測Poly(I:C)的刺激對MSC表型的影響。結(jié)果顯示,Poly(I:C)處理的MSC對CD29、CD44(纖維蛋白和透明脂酸鹽的受體,基質(zhì)細(xì)胞表達(dá))和CD105(即SH-2)表達(dá)呈陽性,CD31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志)、CD45(造血細(xì)胞標(biāo)志)和CD117(多能造血干細(xì)胞標(biāo)志)的表達(dá)呈陰性,與對照組MSC相同,Poly(I:C)不會影響MSC的表型(圖1)。經(jīng)3代以上傳代后,細(xì)胞成分均一,純度在95%以上。

    2.2 Poly(I:C)影響MSC的增殖和凋亡 將MSC以2×104個/孔鋪于48孔板中,分別用1、10、25和50 μg/ml的 Poly(I:C)刺激 MSC 24或48小時,CCK-8檢測對MSC細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),1~50 μg/ml的 Poly(I:C)處理 MSC 24和 48小時,OD450的值均不發(fā)生改變,TLR3的活化不會影響細(xì)胞的增殖(圖2A)。隨后,我們用Annexin-V/PI雙染法檢測不同濃度Poly(I:C)的刺激對MSC細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),低濃度的Poly(I:C)刺激對MSC沒有影響,而Poly(I:C)濃度達(dá)到25 μg/ml后會引起MSC的凋亡(圖2B)。

    圖1 人臍帶MSC的表面標(biāo)志Fig.1 The surface marker of human umbilical cord MSC

    2.3 Poly(I:C)抑制MSC的成骨分化 MSC具有成骨分化的能力,我們用1 μg/ml和10 μg/ml Poly(I:C)處理MSC共21天,檢測了Poly(I:C)的刺激對MSC成骨分化的影響。茜素紅染色結(jié)果顯示,MSC成骨誘導(dǎo)時加入Poly(I:C)刺激,與對照組相比,成骨效率明顯降低(圖3A、B)。通過 Q-PCR檢測成骨標(biāo)志基因,可見Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runtrelated transcription factor 2,RUNX2)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和骨鈣蛋白(Osteocalcin,OC)的表達(dá)均明顯降低(P <0.05),圖3C,與染色結(jié)果相符。

    2.4 MSC抑制Poly(I:C)引起的DC的成熟和功能

    將MSC與骨髓單核細(xì)胞于RPMI1640完全培養(yǎng)基(添加10%FCS胎牛血清,100 μg/ml的青霉素,100 μg/ml的鏈霉素,10 ng/ml的 GM-CSF,1 ng/ml IL-4)中共培養(yǎng)7天,單核細(xì)胞被誘導(dǎo)成未成熟DC,加入Poly(I:C)刺激24小時。流式細(xì)胞儀檢測CD11c陽性的DC對MHCⅡ、CD40和CD86的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,MSC共培養(yǎng)組的DC對表面細(xì)胞標(biāo)志CD40、CD86和MHCⅡ的表達(dá)與單獨Poly(I:C)刺激組的DC相比顯著降低(P<0.05)(圖4A、B)。結(jié)果說明,在Poly(I:C)的刺激下,MSC能夠抑制DC成熟表面標(biāo)志的表達(dá)。

    圖2 Poly(I:C)對MSC的增殖和凋亡的影響Fig.2 The proliferation and apoptosis of MSC after treated with Poly(I:C)

    圖3 Poly(I:C)對MSC成骨分化的影響Fig.3 The Osteogenic differentiation of MSC after treated with Poly(I:C)

    圖4 MSC能夠抑制Poly(I:C)引起的DC的成熟和功能Fig.4 MSC can inhibit the maturation and activation of DC with the treatment of Poly (I:C)

    未成熟DC具有很強(qiáng)的吞噬功能,隨后我們檢測了Poly(I:C)刺激下MSC對DC吞噬功能的影響。結(jié)果顯示,MSC與DC共培養(yǎng)組,DC的吞噬功能比單獨Poly(I:C)刺激組明顯的增強(qiáng)(圖4C),說明MSC能夠抑制DC的成熟,使其處于未成熟狀態(tài)。成熟的DC能夠?qū)⒖乖f呈給T細(xì)胞,并使其活化,促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。我們首先用CFSE標(biāo)記T細(xì)胞,然后將各個處理組[即Poly(I:C)刺激MSCDC共培養(yǎng)組、單獨Poly(I:C)刺激DC組、未刺激DC組]的DC與T細(xì)胞按1∶10的比例共培養(yǎng),3天后流式檢測T細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示,單獨Poly(I:C)刺激組DC能夠顯著的促進(jìn)T細(xì)胞的增殖,而MSC顯著抑制DC細(xì)胞的抗原遞呈功能(圖4D)。以上結(jié)果說明,在Poly(I:C)刺激下,MSC能夠抑制DC的成熟和功能。

    3 討論

    MSC具有自我復(fù)制、多向分化潛能、造血支持、促進(jìn)干細(xì)胞植入、低免疫原性和免疫調(diào)控等特性[16]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),骨髓、脂肪和臍帶來源的MSC都能夠表達(dá)有活性的TLRs[6-12]。

    有研究表明TLRs的活化能夠?qū)SC的分化和增殖產(chǎn)生影響[13-15]。Hwa 等[17]的研究發(fā)現(xiàn),用TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6 和 TLR-9的配體刺激人脂肪來源的MSC,只有TLR9活化能夠促進(jìn)MSC的增殖。LPS和PGN能夠促進(jìn)MSC的成骨分化,CpG則能夠抑制成骨,另外,Poly(I:C)不影響MSC的成骨或成脂分化。Liotta等[6]的研究則認(rèn)為TLR的活化不影響人骨髓來源MSC的成骨、成脂和成軟骨。Lombardo等[10]的研究則認(rèn)為,TLR3和TLR4配體刺激能夠促進(jìn)脂肪來源MSC的成骨分化,但是不影響成脂分化,也不影響細(xì)胞增殖。Raicevic等[18]的研究發(fā)現(xiàn),TLR3和 TLR4配體的刺激能夠促進(jìn)骨髓和脂肪來源MSC的成骨分化,而對臍帶MSC沒有影響。我們的研究發(fā)現(xiàn),在Poly(I:C)的刺激下,人臍帶來源MSC的表型和增殖不發(fā)生改變,但是高濃度的Poly(I:C)會引起MSC的凋亡;茜素紅染色結(jié)果顯示,Poly(I:C)能夠抑制MSC的成骨分化,同樣成骨相關(guān)基因RUNX2、ALP和OC的表達(dá)也明顯受到抑制。

    關(guān)于TLR對MSC免疫調(diào)節(jié)功能產(chǎn)生何種影響仍不清楚。Liotta等[6]的研究發(fā)現(xiàn)TLR3、TLR4的活化會阻斷人骨髓來源BMSC對T細(xì)胞的抑制作用。與此相反,Waterman等[14]的研究則認(rèn)為Poly(I:C)對MSC短時間的活化可以長時間的使其處于免疫抑制功能增強(qiáng)的狀態(tài),對IDO和PGE2的表達(dá)增強(qiáng),對T細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng),而TLR4的活化則使MSC更傾向于成為一種炎性MSC。Opitz等[7]的研究發(fā)現(xiàn)TLR3和TLR4的活化能夠促進(jìn)MSC產(chǎn)生IDO,從而促進(jìn)對T細(xì)胞的抑制作用,增強(qiáng)MSC的免疫抑制功能。這些矛盾的結(jié)果可能與實驗設(shè)計有關(guān)。我們將MSC與DC細(xì)胞共培養(yǎng),加入TLR3配體Poly(I:C)的刺激,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Poly(I:C)存在的情況下MSC能夠抑制DC的活化,增加DC的吞噬功能,使DC趨向于未成熟狀態(tài)。

    本實驗探討了Poly(I:C)對人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞生長、分化和功能的影響,發(fā)現(xiàn)了在TLR3配體存在的情況下,MSC依然具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能,并且Poly(I:C)的刺激能夠顯著的抑制臍帶MSC的成骨分化。臍帶MSC取材方便且生長速度快,易于體外大量擴(kuò)增,具有很高的臨床應(yīng)用前景。我們關(guān)于TLR3對MSC影響的研究為探索炎癥環(huán)境對MSC影響的機(jī)制以及臍帶MSC的體外應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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