超聲影像分析在高脂血癥金黃地鼠模型構(gòu)建中的動態(tài)監(jiān)測

楊康敏，楊 柳，朱海波

(天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，新藥作用機制研究與藥效評價北京重點實驗室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、藥物研究所，北京 100050)

早在19世紀(jì)90年代，敘利亞金黃地鼠(以下簡稱為金黃地鼠)就已用于脂代謝和動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)等相關(guān)研究中［1］。該動物對膽固醇和脂質(zhì)高敏感［2］，脂代謝特點人類相似［3－6］，目前越來越多地被應(yīng)用于脂蛋白代謝、高脂血癥、動脈粥樣硬化發(fā)病機制的研究和藥物開發(fā)中，探討適用于研究金黃地鼠血脂紊亂發(fā)生、發(fā)展及其演化規(guī)律等的技術(shù)手段對規(guī)范化應(yīng)用該模型具有重要意義。超聲檢查作為一種無創(chuàng)、方便、經(jīng)濟(jì)、易重復(fù)、普及率高的檢測手段，已被廣泛應(yīng)用于脂肪肝和動脈粥樣硬化的臨床診斷，同時在實驗研究中也作為重要的技術(shù)方法用于實驗動物諸如豬、兔、大鼠和小鼠的動脈粥樣硬化、脂肪肝、肝纖維化和心肌梗死等研究中［7－10］。為了清晰地顯示小動物器官細(xì)微結(jié)構(gòu)，必須采用高分辨率、高圖像采集速率的超聲影像技術(shù)才能夠?qū)崿F(xiàn)對血管和心臟等器官相關(guān)形態(tài)和功能參數(shù)的精確測量及動態(tài)觀察。金黃地鼠體積大小介于小鼠和大鼠之間，在本研究中我們采用的VisualSonicsR Vero 770R高分辨率小動物超聲系統(tǒng)分辨率達(dá)30 μm，心臟圖像采集在200幀/s以上，結(jié)合心臟M型超聲技術(shù)，可以實現(xiàn)清晰顯示器官圖像，精確測量血管相關(guān)參數(shù)，實時記錄多個心動周期內(nèi)心臟不同部位截面的動態(tài)改變，該系統(tǒng)可以提供非侵入式、連續(xù)性和動態(tài)器官結(jié)構(gòu)及功能研究，所獲得的高分辨率影像為研究者提供更清楚可靠的結(jié)果。在本研究中我們擬采用該系統(tǒng)進(jìn)行無創(chuàng)性超聲影象分析，探討超聲影像技術(shù)在高脂血癥金黃地鼠模型中的應(yīng)用和價值。

1 材料和方法

1.1 動物分組和高脂血癥金黃地鼠模型的建立

10～11周齡雄性敘利亞金黃地鼠32只，北京維通利華實驗動物有限公司(動物許可證號SCXK(京)2012—0001)提供，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組(普通飼料)和高脂血癥模型組(高脂飼料)各16只，在合適環(huán)境 (飼養(yǎng)溫度21±2℃，相對濕度30% ～70%，光照周期14/10 h)下飼養(yǎng)，4只/籠，每3天監(jiān)測動物體重和健康狀態(tài)，動物自由飲食、飲水。

1.2 主要試劑與儀器

高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)(VisualSonicsR Vero 770R)，小動物麻醉機(美國 Matrix)，倒置顯微鏡(Nikon公司)，冰凍切片機(Leica CM 1950)。

戊巴比妥鈉(Sigma公司)，血脂測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，多聚甲醛(Sigma公司)，油紅O(Sigma公司)，HE染色液，異氟烷(河北九派制藥有限公司)，醫(yī)用氧氣(北京如源如泉科技有限公司)。

1.3 血脂監(jiān)測

于 0、3、6、9、14、16、20、24、40 周測定血清甘油三酯 (triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇 (high density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇 (lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)的水平。金黃地鼠過夜禁食12 h，乙醚麻醉，內(nèi)眥靜脈叢取血0.2 mL，3 000 r/min離心 10 min，分離血清用于血脂生化檢測。

1.4 超聲檢查

于20周和40周分別對正常對照組(n=8)和模型組(n=8)金黃地鼠心臟、主動脈弓部和肝臟行超聲檢查。利用小動物麻醉機(美國Matrix)對動物進(jìn)行氣體麻醉，誘導(dǎo)麻醉時異氟烷濃度為2.5%，氧氣流量計控制在0.6 L/min，麻醉后仰臥位固定于檢查臺上，接入呼吸罩，維持麻醉為2%異氟烷和0.5 L/min的氧氣流量，監(jiān)測心電，應(yīng)用高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)(VisualSonicsR Vero 770R，high resolution imaging system，VisualSonics Inc，Canada，探頭頻率30 MHz)，取胸骨旁左室短軸切面，在二尖瓣腱索水平記錄M型超聲運動曲線后，分別測量左室舒張末期內(nèi)徑(end diastolic diameter，EDD)和左室收縮末期內(nèi)徑(end systolic diameter，ESD)，計算短軸縮短率(shortening fraction，F(xiàn)S)和射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)。各指標(biāo)均在連續(xù)3個心動周期上測量后取其平均值。

對肝臟的超聲檢查:觀察內(nèi)容為肝臟的大小，重點觀察肝臟的回聲強弱、是否均勻、后方有無衰減、肝內(nèi)管道的清晰度。

主動脈弓部的超聲檢查:動物臺與水平面形成約15°夾角，探頭縱向?qū)瘘S地鼠心臟上方進(jìn)行掃描，適當(dāng)調(diào)整探頭角度和位置，將聲束與弓部血管壁平行以獲得良好的血管內(nèi)膜回聲，顯示清晰的血管內(nèi)膜回聲后凍結(jié)圖像，記錄主動脈弓部聲像圖。每組動物檢查完畢后調(diào)出超聲工作站上主動脈弓部的二維圖像以測量內(nèi)膜-中膜厚度(IMT)最大值(IMTm)。所有測量工作由一位實驗操作者完成。

1.5 組織病理學(xué)檢查

在第20周和40周時，各組動物超聲檢查完畢后取材，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。動物用戊巴比妥鈉(120 mg/kg)腹腔注射麻醉，打開腹腔后腹主動脈取血，分離肝臟，進(jìn)行圖像拍攝后稱重，計算肝指數(shù)(hepatosomatic index，HSI)(肝臟指數(shù) =肝臟重量/體重 ×100%)。留取肝一葉，切成1 cm×1 cm小塊后用OCT包埋，投入液氮速凍用于油紅O染色。分離主動脈弓部血管，PBS中輕輕沖洗，立即投入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色。對冰凍固定的肝臟組織進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為7 μm，貼片后4%多聚甲醛固定，0.5%油紅O溶液滴染，沖洗，蘇木素復(fù)染，鏡檢。主動脈弓部血管固定后，各級梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，切片，蘇木素和伊紅染色，鏡檢。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高脂血癥金黃地鼠模型的建立

高脂喂飼組金黃地鼠第3周時出現(xiàn)明顯的乳糜血，第3周至40周內(nèi)高脂組TC、TG、HDL-C和LDLC與對照組相比均升高，差異顯著(P＜0.05)(表 1)。

2.2 超聲影像分析

2.2.1 肝臟超聲影像分析:正常肝臟實質(zhì)回聲稍低，分布均勻，可見稀疏散在、短小線狀回聲。第20周時，與對照組相比，高脂組金黃地鼠肝臟超聲圖像的特征為紋理粗糙，肝光點細(xì)密、增強，肝臟可見明顯肝臟腫大，邊緣角圓鈍，肝內(nèi)管道結(jié)構(gòu)顯示不清，判斷為中重度脂肪肝;第40周時，高脂組肝臟超聲圖像顯示脂肪肝病變特征更明顯，肝臟腫大和邊緣圓鈍化更顯著，見圖1D～F。

表1高脂喂飼金鼠不同時間點血脂水平(n=8，ˉ±s)Tab．1 Time course for the changes of serum lipids in the hamsters fed with high fat diet for 40 weeks

表1高脂喂飼金鼠不同時間點血脂水平(n=8，ˉ±s)Tab．1 Time course for the changes of serum lipids in the hamsters fed with high fat diet for 40 weeks

指標(biāo)Indices分組Groups不同時間點血脂水平Concentration(mmol/L)P-value(3 w～40 w)總膽固醇(TC)模型組Model 4.69±0.26 31.34±2.04 22.30±2.75 23.96±4.65 21.20±3.85 24.09±2.34 23.06±4.48 15.40±2.62 18.61±4.08 P＜0.01對照組Control 4.61±0.46 3.64±0.28 4.41±0.44 4.72±0.48 5.72±0.51 4.99±1.44 4.80±01.4 4.36±0.50 3.97±0.61甘油三酯(TG)模型組Model 1.87±0.16 28.21±5.54 15.43±3.60 14.84±5.32 6.36±1.33 8.76±2.55 6.39±1.29 9.94±1.37 7.07±2.56 P＜0.05對照組Control 1.77±0.39 1.74±0.89 1.77±0.36 1.86±0.45 2.03±0.34 1.66±0.42 1.93±0.53 2.81±0.40 1.60±0.37高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)模型組Model 1.11±0.16 6.91±1.54 4.79±0.49 4.91±0.74 3.71±0.66 4.21±0.90 3.72±0.56 2.20±0.36 4.47±0.84 P＜0.05對照組Control 1.14±0.18 1.37±0.10 1.55±0.16 1.69±0.43 1.86±0.19 1.29±0.26 1.35±0.35 1.24±0.19 1.41±0.13低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)模型組Model 1.51±0.12 26.72±3.07 12.56±0.86 12.80±1.14 10.13±3.36 11.65±1.73 9.93±1.85 8.14±1.25 10.47±1.8 P＜0.001對照組Control 1.57±0.42 1.29±0.19 0.86±0.13 1.34±0.37 3.04±0.55 3.57±0.49 1.64±0.29 1.62±0.27 0.91±0.24

2.2.2 主動脈弓部超聲影像分析:正常金黃地鼠的主動脈弓部管壁在聲像圖上顯示為三層結(jié)構(gòu)，即中等回聲的內(nèi)膜、強回聲的外膜和內(nèi)外層之間的低回聲或無回聲的中膜，內(nèi)膜纖細(xì)光滑，連續(xù)性良好。第20周時高脂組金黃地鼠主動脈弓部IMTm與對照組相比顯著增大(P＜0.000 1)，管腔內(nèi)膜面粗糙，有小而不規(guī)則突起，三層結(jié)構(gòu)依稀可辨;40周時，IMTm顯著高于對照組和20周時 IMTm值(P＜0.000 1)，可觀察到彌散分布的較強斑塊回聲，整體呈多層不規(guī)則片層狀向管腔面突起(圖1G～I(xiàn)，表 2)(圖 1見彩插 3)。

2.2.3 心臟超聲影像分析

高脂血癥金黃地鼠造模第20周和40周時心功能與正常對照組相比差異無顯著性，EDD、ESD、EF和FS均無明顯變化(P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義)，見表 2。

2.3 組織病理學(xué)改變

2.3.1 肝臟病理學(xué)改變:大體標(biāo)本觀察正常組動物肝臟呈鮮紅色，邊緣銳利，表面光滑，質(zhì)地柔軟，體積無增大;第20周時高脂組動物肝臟顏色呈邊緣黃白、中心紅紫與黃白色相交，邊緣圓鈍，表面粗糙，包膜緊張，體積明顯增大;40周時動物肝臟腫脹更嚴(yán)重，顏色整體呈黃白色，質(zhì)地較硬(圖1A～C)。第20周和40周時高脂組與正常組相比肝指數(shù)顯著升高(P＜0.001)，見表2。染色切片顯示，正常組肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核分布均勻，體積正常，偶見細(xì)小鮮紅脂滴，見圖2A。高脂組20周時，肝臟細(xì)胞不均勻增大，排列不規(guī)則，整個視野充滿融合成片的鮮紅大脂滴，呈重度肝脂肪變，細(xì)胞核分布不均勻，出現(xiàn)大量的細(xì)胞核密集區(qū)，見圖2B;40周時，除成片的細(xì)胞核密集區(qū)外細(xì)胞核分布稀疏，鮮紅著色脂質(zhì)已完全融合成片，細(xì)胞脂肪變進(jìn)一步加重，見圖2C。

2.3.2 主動脈弓部病理學(xué)改變:光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常組單層內(nèi)皮細(xì)胞完整，中層平滑肌細(xì)胞排列整齊，呈長型或橢圓型，胞漿無明顯脂質(zhì)沉積，見圖2D。高脂組在第20周時，內(nèi)膜已不完整，出現(xiàn)泡沫細(xì)胞聚集，平滑肌細(xì)胞增殖且胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴空泡，見圖2E。40周時，內(nèi)膜側(cè)平滑肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多脂滴空泡，大量泡沫細(xì)胞聚集成片，出現(xiàn)脂質(zhì)核，明顯隆起于內(nèi)膜表面，形成粥樣斑塊，見圖2F(圖2見彩插4)。

3 討論

金黃地鼠對脂質(zhì)高度敏感，高膽固醇和高脂喂飼后易形成高脂血癥和動脈粥樣硬化［1，11］。高脂血癥會導(dǎo)致脂肪肝的形成，同時它也是As最重要的誘發(fā)因素之一，對脂肪肝和心血管病變發(fā)生、發(fā)展的動態(tài)觀察是研究高脂血癥和動脈粥樣硬化發(fā)病過程和創(chuàng)新藥物藥效學(xué)評價不可或缺的內(nèi)容。傳統(tǒng)的實驗研究方法多采用組織病理學(xué)檢查，這就需要在實驗過程中處死動物以獲取組織樣本，導(dǎo)致研究成本較高且無法在同一動物中實現(xiàn)連續(xù)動態(tài)監(jiān)測。本研究采用高清晰小動物專用超聲成像系統(tǒng)，在不同造模時間點對高脂血癥金黃地鼠的肝臟、血管和心臟形態(tài)和功能進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，通過與傳統(tǒng)研究手段對比，綜合評價超聲影像分析技術(shù)在高脂血癥金黃地鼠模型相關(guān)研究中應(yīng)用價值。

目前超聲診斷是廣泛應(yīng)用于臨床上檢查診斷肝臟脂肪變的便捷手段，而AS病變的影像學(xué)評價通常以血管造影為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但近年來，隨著超聲技術(shù)的發(fā)展及病理標(biāo)本檢測增加，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，IMT的增加是 AS早期表現(xiàn)，因此應(yīng)用無創(chuàng)性的影像學(xué)方法如超聲評價AS成為研究的熱點。

表3高脂血癥金黃地鼠不同時期IMTm、HSI和心臟功能的變化(n=8，±s)Tab．3 Comparison of IMTm，hepatosomatic index and heart function between the control and hyperlipidemic hamsters at different periods

表3高脂血癥金黃地鼠不同時期IMTm、HSI和心臟功能的變化(n=8，±s)Tab．3 Comparison of IMTm，hepatosomatic index and heart function between the control and hyperlipidemic hamsters at different periods

注:與各正常對照組相比，aP＜0.0001，cP＜0.001;與20周時比，bP＜0.0001。Note:aP ＜0.0001，cP ＜0.001，vs．control values;bP ＜0.000 1，vs．values at 20 weeks．

Indices正常組Control group高脂組Hyperlipidemia group正常組Control group高脂組Hyperlipidemia group內(nèi)膜-中膜厚度(IMT)最大值(IMTm)(mm) 0.090 ±0．015 0.183 ±0．031a 0.119 ±0．009 0.026 ±0．045a，b肝指數(shù)(HIS) 0.034±0．004 0.070±0．012c 0.038±0．003 0.070 ±0．016c左室舒張末期內(nèi)徑(EDD)(mm) 3.05±0．13 3.30 ±0．15 3.24±0．35 3.67±0．53左室收縮末期內(nèi)徑(ESD)(mm) 0.67±0．13 0.65 ±0．19 0.97±0．33 1.21±0．68射血分?jǐn)?shù)(EF)(%) 96.82±4．44 96.65±8．78 96.75±4．15 90.41±11．3短軸縮短率(FS)(%) 79.46±12．89 85.25±16．15 80.38±14．06 67.75±18．2

肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉著，對超聲波能量吸收明顯，并產(chǎn)生散射作用，使聲能主要為肝的前場所吸收，而后場發(fā)生明顯衰減，肝回聲增強，肝臟腫大，肝內(nèi)血管顯示不清，此為彌漫性脂肪肝超聲圖像的特征性表現(xiàn)。本研究中金黃地鼠高脂喂飼造模20周時肝臟聲像圖即表現(xiàn)出明顯的脂肪肝特征，這些特征隨著高脂喂飼時間延長至40周時更加明顯，隨后的病理檢查結(jié)果證實金黃地鼠高脂喂飼至20周時已形成重度脂肪肝，可見超聲用于該模型脂肪肝的診斷是可靠的，不足是以上為傳統(tǒng)的脂肪肝超聲判斷，判斷指標(biāo)主要依賴于操作者的主觀經(jīng)驗，有可能影響脂肪肝的分級判定，目前國內(nèi)外學(xué)者已開始構(gòu)建較為客觀、量化的、單指標(biāo)或多指標(biāo)診斷體系［12，13］，這為本研究體系進(jìn)一步的完善提供借鑒。

超聲顯示正常金黃地鼠主動弓部血管壁由內(nèi)膜、中膜和外膜三層構(gòu)成。二維超聲圖像表現(xiàn)為典型的“雙線征”，即兩條平行的強回聲被一低回聲或無回聲區(qū)所分隔，兩條回聲線之間的距離即為IMT。IMT的增加被多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是 AS的早期表現(xiàn)，本研究中通過超聲測量出高脂血癥地鼠不同時期主動脈弓部IMT并統(tǒng)計出差異。超聲聲像圖還清晰地顯示出主動脈弓部血管壁形態(tài)，高脂血癥金黃地鼠造模第20周時內(nèi)膜側(cè)粗糙，出現(xiàn)向管腔側(cè)凸起微小斑塊的強回聲，第40周時，呈現(xiàn)成片的大斑塊回聲，相應(yīng)的組織病理檢查結(jié)果與之相吻合。

總之，通過上述的研究證明超聲技術(shù)可用于監(jiān)測金黃地鼠模型體內(nèi)脂肪肝的形成和IMT改變，可動態(tài)無創(chuàng)地觀察主動脈弓部形態(tài)改變和預(yù)測早期AS病變。

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