• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    OX-LDL 與單核巨噬細(xì)胞相互作用促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成

    2013-11-27 05:27:04趙詩(shī)萌吳紅敏

    張 良,韓 丹,趙詩(shī)萌,吳紅敏

    (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科,沈陽(yáng) 110001)

    動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是影響人類 健康最嚴(yán)重,最常見(jiàn)的心血管疾病之一,是人類當(dāng)前死亡的一個(gè)主要病因。對(duì)免疫組織化學(xué)方法及超級(jí)形態(tài)學(xué)研究表明形成于AS病變?cè)缙诘呐菽?xì)胞主要是由單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞吞噬大量脂質(zhì)而形成的,而且存在于AS病變的始終,也有助于探索對(duì)AS病變的防治研究。其發(fā)病機(jī)制涉及炎性反應(yīng)、脂質(zhì)代謝失

    調(diào)及氧化應(yīng)激等多種病理生理機(jī)制[1-3]。其中,低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的氧化修飾被認(rèn)為是 AS形成的關(guān)鍵啟動(dòng)因素[4].氧化性低密度脂蛋白(OX-LDL)與單核巨噬細(xì)胞間的相互作用是泡沫細(xì)胞形成的重要機(jī)制。目前已從細(xì)胞形態(tài)學(xué),生物化學(xué)等方面對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了不同方面的闡述,但關(guān)于泡沫化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)變化情況的研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。

    本研究采用一次性密度梯度超速離心方法由健康成人血漿中分離出低密度脂蛋白,由硫酸銅溶液氧化24 h制備成氧化型低密度脂蛋白,同體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞相互作用,建立巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型,并動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)成分(主要為總膽固醇TC、游離膽固醇FC、膽固醇酯EC)量的改變及細(xì)胞形態(tài)的變化過(guò)程,以初步探討單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的可能機(jī)制。

    1 材料和方法

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,純系 615小鼠[5-6](遼實(shí)動(dòng)質(zhì)字.(2000)015號(hào)),雄性 20~25 g,8~10周。健康成人新鮮血 200 mL(EDTA抗凝)固體 NaBr,固體CuSO4購(gòu)于沈陽(yáng)試劑三廠,分析純品 DMEM培養(yǎng)基(美國(guó) Gibco,總膽固醇試劑盒及游離膽固醇試劑盒,購(gòu)于北京天象人生物工程高技術(shù)公司,LDL標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

    1.1 低密度脂蛋白的制備、鑒定和定量分析

    取新鮮全血室溫靜止后棄血凝于4℃,4 000 r/min離心30 min獲血清,加入0.05%NaN3,100 mg/L EDTA 防 腐、防 氧 化。再 于 4℃,12 000 r/min離心30 min后除去上層乳糜微粒(CM)后備用。配置密度液,以固體NaBr調(diào)整血清密度為1.3 g/mL,分別配制密度為1.2 g/mL NaBr,1.006 g/mL NaCl溶液及1.0 g/mL雙蒸水,(其中含0.01%EDTA,pH 7.6)用Abbe折光儀測(cè)定折光率,用CRC Handbook of Chemistry and Physics查得所對(duì)應(yīng)的密度,調(diào)整所配溶液的密度。按郭剛及 Byung H.的方法建立密度梯度于(10~15)℃,542 000 r/min(28 000 g)條件下超速離心5 h,吸出中間黃色液體為L(zhǎng)DL(d=1.040 0~1.056 0),經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,LDL定量分析按Lowry方法測(cè)定蛋白含量,在Shimadzu UV-260紫外分光光度計(jì)上測(cè)595 nm處A值。LDL在4℃含10 mg/L EDTA的0.01 mol/L PBS中避光透析72 h,中間8 h換液一次,過(guò)濾除菌,4℃保存。

    1.2 低密度脂蛋白的氧化修飾及修飾程度鑒定

    將LDL于0.01 mol/L PBS中充分透析24 h除去EDTA后放置于終濃度為5 μmol/L的硫酸銅溶液中 37℃ 氧化 24 h加入終濃度為 200 μmol/L EDTA終止氧化反應(yīng),而后于4℃含100 mg/L EDTA的0.01 mol/L PBS中透析24 h。用硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(thiobarbituric acid reactive substance,TABRS)的含量來(lái)鑒定LDL的修飾程度。采用方明的方法測(cè)定TBARS含量,總膽固醇的定量分析根據(jù)CHOD-PAP方法測(cè)得,LDL的氧化修飾程度以每克膽固醇的TBARS含量來(lái)表示。

    1.3 巨噬細(xì)胞的收集和培養(yǎng)

    取純系 615健康小鼠(雄性 20~25 g,8~10周)普通飼料喂養(yǎng)1周后將小鼠斷頸處死,消毒后腹腔內(nèi)注射無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液5 mL,收集腹腔液以800 r/min離心10 min棄上清液收集細(xì)胞,用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度,以109/L密度種植在45 mL培養(yǎng)瓶中,每瓶約3 mL,在37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棄培養(yǎng)液,PBS沖洗掉未貼壁的細(xì)胞。分成3組,分別加入空白對(duì)照液(含 20%小牛血清,100 kU/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素DMEM培養(yǎng)液),含10 mg/L LDL及10 mg/L OX-LDL 培養(yǎng)液各 3 mL,繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72、96 h,另分為五組,分別加入含 10、30、50、100 μg/L LDL或OX-LDL培養(yǎng)液。

    1.4 細(xì)胞內(nèi)膽固醇的定量分析

    將培養(yǎng)后的細(xì)胞棄培養(yǎng)液用PBS沖洗3次,冰浴30 min后用橡皮刮子刮下細(xì)胞800 r/min離心10 min收集細(xì)胞,加入0.5 mL異丙醇,勻漿破碎細(xì)胞,800 r/min離心10 min取上清液用總膽固醇試劑盒及游離膽固醇試劑盒分別測(cè)定總膽固醇(TC)及游離膽固醇(FC)含量,沉淀用0.1 mol/L NaOH 0.2 mL裂解細(xì)胞,用Lowry法測(cè)得細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量。細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量用每克蛋白所含的總膽固醇,游離膽固醇和膽固醇酯來(lái)表示,膽固醇酯(CE)含量由總膽固醇與游離膽固醇的差值來(lái)獲得。

    1.5 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

    將收集的腹腔巨噬細(xì)胞以109/L密度接種于3.5×1.5 cm2蓋玻片,實(shí)驗(yàn)條件同前。培養(yǎng)結(jié)束后以PBS洗3次采用蘇丹III-IV混合染色的方法。

    取培養(yǎng)24 h后的巨噬細(xì)胞PBS沖洗3次取下細(xì)胞離心收集,于細(xì)胞團(tuán)塊中加入2.5%戊二醛4℃固定3 h,梯度丙酮脫水,樹(shù)脂包埋,切片后經(jīng)醋酸雙養(yǎng)鈾-枸櫞酸鉛雙重染色后,用JEM-2000EX透射電鏡攝片。

    1.6 CD54和CD36測(cè)定

    消化并收集細(xì)胞,以1 000 r/min離心10 min,棄上清,用 PBS沖洗 2次,然后加入 20 μL CD54、CD36抗體避光染色20 min,加入400 μL PBS置于流式細(xì)胞儀下進(jìn)行檢測(cè)。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著性檢驗(yàn)用配伍組設(shè)計(jì)的多個(gè)樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)

    2 結(jié)果

    2.1 低密度脂蛋白的鑒定、定量分析及氧化低密度脂蛋白氧化程度鑒定

    利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)采用5%分離膠,3%濃縮膠,以血清蛋白為對(duì)照鑒定所制備低密度脂蛋白,經(jīng)考馬氏亮藍(lán)染色為單一區(qū)帶,且位置與血清β-球蛋白位置相當(dāng),利用電子計(jì)算機(jī)圖像分析儀測(cè)定相對(duì)純度可達(dá)92.39%,蛋白含量為1.26 mg/mL,總膽固醇含量為60.85 mg/dL,基本上與以往文獻(xiàn)報(bào)道相符。LDL氧化修飾程度:LDL為2.87 μmol/g,OX-LDL 為 26.5 μmol/g(圖 1)。

    圖1 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定、定量LDL和OX-LDLFig.1 Quantification of LDL and OX-LDL by polyacrylamide gel electrophoresis

    2.2 低密度脂蛋白的氧化修飾及修飾程度鑒定

    為進(jìn)一步研究低密度脂蛋白與氧化型低密度脂蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞影響,我們進(jìn)行了在不同時(shí)間(表1、圖2)、不同濃度條件下(表2、圖3)對(duì)LDL和ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)分析(圖2~3)。

    2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

    培養(yǎng)24 h后刮下貼壁細(xì)胞,經(jīng)電鏡觀察可見(jiàn)不同層面的細(xì)胞均呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征,直徑大約為5~10 μm,邊緣犬牙交錯(cuò)的細(xì)胞核周?chē)旧|(zhì),胞漿稀少含有大量的核糖體,線粒體豐富,同時(shí)還含有小的囊狀結(jié)構(gòu)及一定數(shù)目的致密顆粒,為溶酶體結(jié)構(gòu)。說(shuō)明貼壁細(xì)胞基本上來(lái)源于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(圖4)。

    2.4 細(xì)胞內(nèi)膽固醇的定量分析

    圖2 不同時(shí)間條件下巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Fig.2 Morphological changes of macrophages at different time points

    圖3 不同濃度巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Fig.3 Morphological changes of macrophages at different concentrations

    表1 不同時(shí)間條件下巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Tab.1 Morphological changes of macrophages at different time points

    表2 不同濃度下巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Tab.2 Morphological changes of macrophages at different concentrations

    圖4 24 h后的巨噬細(xì)胞電鏡結(jié)果Fig.4 Electron micrographs of LDL-and ox-LDL-treated macrophages after 24 h

    用無(wú)脂蛋白DMEM培養(yǎng)的單核巨噬細(xì)胞為對(duì)照培養(yǎng)組,實(shí)驗(yàn)結(jié)果單核巨噬細(xì)胞與10 mg/L的LDL或OX-LDL孵育不同時(shí)間后,細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇和游離膽固醇均較對(duì)照組明顯增加,且OX-LDL組比LDL組更為顯著。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)LDL組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇,游離膽固醇的量保持相對(duì)恒定,而OX-LDL組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇持續(xù)增加,游離膽固醇的含量基本不變,膽固醇酯的含量逐漸增加。最終表現(xiàn)為膽固醇酯在總膽固醇的比例增大約占50%左右,符合泡沫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)定義。

    以不同濃度的LDL及OX-LDL同巨噬細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,可見(jiàn)隨濃度的增加LDL組及OX-LDL組細(xì)胞內(nèi) TC、FC、CE均較對(duì)照組明顯增加,且 OXLDL組較LDL組更為明顯。其中LDL組在高濃度時(shí)仍表現(xiàn)為一定的飽和性,即 TC、FC、CE三者相對(duì)恒定,而OX-LDL組則表現(xiàn)為當(dāng)濃度小于50 μg/mL時(shí)隨濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE逐漸增加,在30~50 μg/mL時(shí)尤為明顯,當(dāng)濃度大于 50 μg/mL時(shí),隨濃度的增加細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量反而減少(圖5)。

    圖5 不同時(shí)間 TC、FC、CE變化情況Fig.5 Expression of TC,F(xiàn)C,CE at different time points

    2.5 ox-LDL對(duì)細(xì)胞內(nèi)CD54表達(dá)的影響

    本研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞表面CD54的表達(dá),LDL誘導(dǎo)表達(dá)作用不明顯(圖6)。

    圖6 LDL ox-LDL對(duì)細(xì)胞內(nèi)CD54變化影響Fig.6 Effects of LDL and ox-LDL on CD54 expression in the cells

    本研究還進(jìn)一步的觀察了細(xì)胞在LDL和ox-LDL慢性刺激下CD36的表達(dá)情況。在泡沫細(xì)胞的形成中,CD36介導(dǎo)的對(duì)修飾的 LDL(包括 Ox-LDL和乙酞化的LDL)的內(nèi)吞起著重要的作用,研究顯示,LDL,ox-LDL可以促進(jìn)細(xì)胞膜表面受體CD36的表達(dá)(圖7)。

    3 討論

    圖7 LDL ox-LDL對(duì)細(xì)胞表面受體CD36變化影響Fig.7 Effects of LDL and ox-LDL on CD36 expression in the cells

    本文采用一次性密度梯度超速離心的方法,綜合以往文獻(xiàn)的經(jīng)驗(yàn),成功地由健康人血漿中分離出低密度脂蛋白,并在體外由Cu2+氧化制備成氧化型低密度脂蛋白,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳及測(cè)定TBARS含量鑒定其純度及氧化程度同以往文獻(xiàn)記載基本一致,滿足本實(shí)驗(yàn)的要求。

    統(tǒng)一培養(yǎng)條件下不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的含量,OX-LDL組較LDL組增高,我們分析此現(xiàn)象原因有三,第一,可能是巨噬細(xì)胞對(duì)OX-LDL的攝取速度高于對(duì)LDL的攝取,由于OX-LDL其結(jié)構(gòu)的改變而使之與LDL受體親合性下降轉(zhuǎn)而通過(guò)與之具有更高親合性的清道夫受體特異性相結(jié)合,為巨噬細(xì)胞大量吞噬。第二,M體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中加入OX-LDL后可以刺激其產(chǎn)生巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF),MCSF可以在DNA水平促進(jìn)SR基因表達(dá),促使巨噬細(xì)胞對(duì)OX-LDL的攝入。第三,OX-LDL可以誘導(dǎo)一種細(xì)胞內(nèi)核受體 PPARr表達(dá),該受體可以同編碼脂代謝有關(guān)的酶和蛋白的結(jié)構(gòu)基因結(jié)合,而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。而當(dāng)巨噬細(xì)胞同OX-LDL相作用時(shí),PPARr高水平表達(dá)直接作用于細(xì)胞表面CD36受體基因使之高水平轉(zhuǎn)錄翻譯從而使細(xì)胞表面CD36受體數(shù)目增多而使OX-LDL攝入量進(jìn)一步增加。

    巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)堆積的脂質(zhì)逐漸增多,當(dāng)堆積的脂質(zhì)超過(guò)了細(xì)胞的清除能力則形成特征性的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。當(dāng)巨噬細(xì)胞以胞飲的方式攝取大量 OX-LDL后,由于OXLDL其組成結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的改變,細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝異常,OX-LDL-受體復(fù)合物首先進(jìn)入溶酶體內(nèi),胞漿內(nèi)ACAT由于OX-LDL的進(jìn)入而被激活,在ATP供能情況下將FC同油酸再次酯化,形成膽固醇酯,無(wú)法通過(guò)細(xì)胞膜排除細(xì)胞外,在電鏡下觀察為無(wú)膜包繞的脂滴形式存在于細(xì)胞內(nèi)。故在24~48 h,細(xì)胞內(nèi)CE較FC增加迅速,所占細(xì)胞內(nèi)總膽固醇比例高。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),溶酶體內(nèi)來(lái)源于OX-LDL的神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin,SM)堆積,形成 SM-UC顆粒,使 UC不能通過(guò)溶酶體膜,溶酶體滲透性下降,SMase的活性而導(dǎo)致大量的非酯化膽固醇堆積于溶酶體內(nèi),而無(wú)法進(jìn)入胞漿 FC代謝庫(kù),使 CE生成下降,酯化作用減慢。故隨著時(shí)間的增加,表現(xiàn)為FC增加,而CE增加較明顯,但總膽固醇始終表現(xiàn)為增加。清道夫受體的表達(dá)與活性不受體內(nèi)游離膽固醇水平的負(fù)反饋調(diào)節(jié),因此可以無(wú)限制攝取氧化低密度脂蛋白,隨著OX-LDL的大量攝入,表現(xiàn)為OX-LDL分解減少,而以脂蛋白形式存在于細(xì)胞內(nèi),其apoB的抗原活性保留,同時(shí)含有以膽固醇酯為主的脂質(zhì)。因此表現(xiàn)為FC量基本不變,而CE量仍表現(xiàn)為增加,TC量增加。

    研究發(fā)現(xiàn)OX-LDL中含有的過(guò)氧化產(chǎn)物L(fēng)OOH及溶血卵磷酯對(duì)體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞有毒性作用,可以破壞細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu),改變其通透性,從而使細(xì)胞壞死,脫壁。無(wú)論巨噬細(xì)胞是調(diào)亡還是壞死都是細(xì)胞代謝等一系列生命活動(dòng)的終止,走向死亡的標(biāo)志,在宏觀上表現(xiàn)為當(dāng) OX-LDL濃度〉50 μg/mL時(shí),隨著濃度的增加細(xì)胞內(nèi) TC,F(xiàn)C及CE的量反而減少。此外,同一濃度下OX-LDL組較LDL組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量明顯增高,說(shuō)明OX-LDL較LDL更易使單核巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞。

    已有研究表明,巨噬細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白一細(xì)胞骨架在動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白膽固醇醋化中起著重要的作用。本研究表明,巨噬細(xì)胞中CD36介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞伴隨著 F-actni網(wǎng)絡(luò)的增加[7]。Ox-LDL顯著誘導(dǎo)CD36的提高。結(jié)果提示,在胞漿區(qū)局部F-actin的積聚不但存在己有肌動(dòng)蛋白纖維的重新分布,而且也有新的actin多聚化產(chǎn)生。

    ICAM-1即CD54是屬于免疫球蛋白超家族的一種細(xì)胞粘附分子,正常情況下僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞較大量地持續(xù)表達(dá),它與單核細(xì)胞表面的白細(xì)胞功能相關(guān)抗原LFA-I、巨噬細(xì)胞分化抗原 Mac-D以配體一受體的方式結(jié)合并參與介導(dǎo)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附[8]。受炎癥因子、內(nèi)毒素等刺激后也可使單核細(xì)胞上微量表達(dá)的CIAM-1上調(diào),在多種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)人IAM-I的表達(dá),包括內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、濾泡樹(shù)突細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。本研究檢測(cè)了 LDL與 ox-LDL對(duì)細(xì)胞內(nèi)CD54的表達(dá),結(jié)果顯示 ox-LDL可以增加細(xì)胞內(nèi)CD54表達(dá),提示單核細(xì)胞的積聚可能隨ox-DLD增加而增加。

    [1] Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Nature,1993,362(6423):801 -809.

    [2] Katagiri H,Yamada T,Oka Y.Adiposity and cardiovascular disorders:disturbance of the regulatory system consisting of humoral and neuronal signals[J].Circ Res,2007,101(1):27-39.

    [3] Glass CK,Witztum JL.Atherosclerosis:the road ahead[J].Cell,2001,104(4):503 -516.

    [4] Steinberg D.Atherogenesis in perspective:hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime[J].Nat Med,2002,8(11):1211-1217.

    [5] 李 莉,張錦,劉聰,等.致動(dòng)脈粥樣硬化食小鼠的肝臟改變及其清道夫受體B1的表達(dá)[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2004,4(14):100.

    [6] 盧笑叢,王有為.血脂類代謝研究中的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2004,5(14):313-317.

    [7] Vicca S,Massy ZA,Hennequin C,et al.Apoptotic pathways involved in U937 cells exposed to LDL oxidized by hypochlorous acid[J].Free Radic Biol Med,2003,35(6):603-615.

    [8] Vijayagopal P, Srinivasan SR, Lipoprotein-proteoglycan complexes from atherosclerotic lesions promote cholesteryl ester accumulation in human monocytes/macrophages[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol 1992,12(2):237-249.

    国产麻豆69| 三级毛片av免费| 一级a爱视频在线免费观看| 国产高清videossex| 欧美乱妇无乱码| 久久久久久大精品| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 日韩免费av在线播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 日本wwww免费看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 免费观看精品视频网站| 国产免费男女视频| 久久久久久人人人人人| 欧美在线黄色| 成人免费观看视频高清| 欧美激情高清一区二区三区| 久久精品亚洲av国产电影网| 美女扒开内裤让男人捅视频| 丝袜美足系列| 精品国产超薄肉色丝袜足j| www.自偷自拍.com| 一进一出好大好爽视频| 丝袜美腿诱惑在线| 一区二区三区精品91| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产在线精品亚洲第一网站| 女性被躁到高潮视频| 亚洲在线自拍视频| 在线国产一区二区在线| 亚洲国产精品合色在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 精品免费久久久久久久清纯| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产精品日韩av在线免费观看 | 99riav亚洲国产免费| 欧美日韩一级在线毛片| 高清在线国产一区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 曰老女人黄片| 日韩精品青青久久久久久| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产精品二区激情视频| 国产有黄有色有爽视频| 久久久国产成人免费| 午夜老司机福利片| 在线播放国产精品三级| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 精品久久久久久,| 久久天堂一区二区三区四区| 免费少妇av软件| 一区福利在线观看| 亚洲第一av免费看| 久久久久久人人人人人| 美女大奶头视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲自拍偷在线| 亚洲激情在线av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 日韩大尺度精品在线看网址 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲精品在线观看二区| www.999成人在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 在线观看一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲五月色婷婷综合| 少妇被粗大的猛进出69影院| 两性夫妻黄色片| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久婷婷成人综合色麻豆| 男女床上黄色一级片免费看| 三级毛片av免费| netflix在线观看网站| 国产精品影院久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日本三级黄在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日韩免费av在线播放| av视频免费观看在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲人成电影免费在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲色图av天堂| 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲激情在线av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 制服诱惑二区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 岛国在线观看网站| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产av又大| 欧美一级毛片孕妇| 看片在线看免费视频| 亚洲欧美激情在线| 神马国产精品三级电影在线观看 | 十八禁网站免费在线| 国产成人精品在线电影| 99国产精品一区二区蜜桃av| 女警被强在线播放| 俄罗斯特黄特色一大片| 99香蕉大伊视频| 大码成人一级视频| 在线观看舔阴道视频| 国产一区二区三区视频了| 99re在线观看精品视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 人人妻人人澡人人看| 午夜老司机福利片| 亚洲中文日韩欧美视频| 夫妻午夜视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 美女福利国产在线| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 淫妇啪啪啪对白视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 黄色毛片三级朝国网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲国产欧美网| 99国产精品99久久久久| 成年版毛片免费区| 在线视频色国产色| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产熟女午夜一区二区三区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美日韩黄片免| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产麻豆69| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲欧美一区二区三区久久| 男女午夜视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久久国内视频| 国产激情久久老熟女| 在线观看免费高清a一片| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品亚洲一级av第二区| 99久久人妻综合| 国产在线观看jvid| 一夜夜www| 波多野结衣一区麻豆| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲国产精品合色在线| 久久亚洲精品不卡| 美女高潮到喷水免费观看| 天天添夜夜摸| 国产麻豆69| 免费在线观看日本一区| 在线观看66精品国产| 成年版毛片免费区| 丁香欧美五月| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产高清国产精品国产三级| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久中文看片网| 亚洲黑人精品在线| 一级a爱片免费观看的视频| 麻豆久久精品国产亚洲av | av视频免费观看在线观看| 宅男免费午夜| 电影成人av| 欧美一级毛片孕妇| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲美女黄片视频| 99re在线观看精品视频| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲片人在线观看| 亚洲av美国av| 露出奶头的视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 黑丝袜美女国产一区| 深夜精品福利| 国产成人系列免费观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品免费视频内射| 91麻豆av在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| av在线播放免费不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 一区福利在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲人成电影观看| 成人亚洲精品av一区二区 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲自拍偷在线| 国产午夜精品久久久久久| 久9热在线精品视频| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲 国产 在线| 久久中文看片网| 国产精品成人在线| 在线国产一区二区在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 久久伊人香网站| 亚洲专区国产一区二区| 一二三四在线观看免费中文在| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 制服人妻中文乱码| 欧美日韩黄片免| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 后天国语完整版免费观看| 欧美日韩一级在线毛片| 久久性视频一级片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产91精品成人一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 窝窝影院91人妻| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲欧美激情在线| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲全国av大片| 久久影院123| 亚洲色图综合在线观看| 1024视频免费在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲人成77777在线视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 99久久精品国产亚洲精品| 久久国产精品人妻蜜桃| 黑丝袜美女国产一区| 黄频高清免费视频| 99久久综合精品五月天人人| 久久青草综合色| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产xxxxx性猛交| 午夜亚洲福利在线播放| 这个男人来自地球电影免费观看| 天堂影院成人在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 不卡av一区二区三区| 成人三级黄色视频| 久久中文看片网| 性少妇av在线| 级片在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美在线一区亚洲| 91精品三级在线观看| 大型av网站在线播放| 国产精品亚洲av一区麻豆| 成人永久免费在线观看视频| 免费看a级黄色片| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲成国产人片在线观看| 高清欧美精品videossex| 久久精品国产清高在天天线| 日韩视频一区二区在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 我的亚洲天堂| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 99国产精品免费福利视频| 免费搜索国产男女视频| 午夜精品在线福利| 大码成人一级视频| 9色porny在线观看| 女性被躁到高潮视频| 午夜免费成人在线视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 男人操女人黄网站| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品国产区一区二| 精品一区二区三卡| 香蕉丝袜av| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产91精品成人一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 看片在线看免费视频| 日韩欧美三级三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 又紧又爽又黄一区二区| 深夜精品福利| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 曰老女人黄片| 久久香蕉国产精品| 夫妻午夜视频| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品 国内视频| 国产亚洲欧美98| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成人免费观看视频高清| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产亚洲欧美98| 国产精品亚洲一级av第二区| 交换朋友夫妻互换小说| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成人黄色视频免费在线看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 午夜福利欧美成人| x7x7x7水蜜桃| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 老鸭窝网址在线观看| 美国免费a级毛片| 在线永久观看黄色视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 在线观看www视频免费| 夜夜爽天天搞| 亚洲欧美一区二区三区久久| 精品一品国产午夜福利视频| 超色免费av| 欧美精品啪啪一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 国产麻豆69| 纯流量卡能插随身wifi吗| 男女下面插进去视频免费观看| 又黄又粗又硬又大视频| 天堂√8在线中文| 亚洲情色 制服丝袜| 在线视频色国产色| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲午夜理论影院| 国产免费现黄频在线看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 一a级毛片在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| ponron亚洲| 丝袜人妻中文字幕| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲精品中文字幕一二三四区| 91麻豆av在线| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日韩三级视频一区二区三区| 久久青草综合色| 国产精品二区激情视频| 黄色丝袜av网址大全| 国产xxxxx性猛交| 午夜精品久久久久久毛片777| 日本黄色视频三级网站网址| 麻豆av在线久日| 欧美日韩av久久| 国产免费现黄频在线看| 韩国av一区二区三区四区| 免费av毛片视频| 国产片内射在线| 男人舔女人的私密视频| 又大又爽又粗| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产黄色小视频在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 亚洲人与动物交配视频| 日韩精品中文字幕看吧| 中文字幕熟女人妻在线| netflix在线观看网站| 九色成人免费人妻av| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美bdsm另类| 国产久久久一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区 | 日韩欧美精品免费久久 | 亚洲成av人片免费观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 天美传媒精品一区二区| 亚洲成av人片在线播放无| 久久久久久久午夜电影| 亚洲不卡免费看| 成人av一区二区三区在线看| 在线观看午夜福利视频| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久精品欧美日韩精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 深夜精品福利| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久99久视频精品免费| 国产一区二区三区视频了| 欧美成人性av电影在线观看| av福利片在线观看| 两个人视频免费观看高清| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品,欧美在线| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲专区国产一区二区| 久久久色成人| 久久久久久九九精品二区国产| 一本久久中文字幕| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品人妻偷拍中文字幕| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲成人精品中文字幕电影| 两人在一起打扑克的视频| 成人三级黄色视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产三级在线视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲精品在线观看二区| 51国产日韩欧美| 嫩草影视91久久| 久久久久性生活片| 久久精品人妻少妇| 欧美黄色淫秽网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 成人亚洲精品av一区二区| av中文乱码字幕在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 婷婷精品国产亚洲av| 日本一二三区视频观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 欧美区成人在线视频| 国产亚洲精品久久久com| 白带黄色成豆腐渣| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 俺也久久电影网| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 99riav亚洲国产免费| 在线播放无遮挡| 69人妻影院| av天堂中文字幕网| 69人妻影院| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 麻豆成人午夜福利视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 精品免费久久久久久久清纯| 女同久久另类99精品国产91| 老鸭窝网址在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产在线男女| 国产精品爽爽va在线观看网站| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 色综合站精品国产| 午夜视频国产福利| 日本a在线网址| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产伦精品一区二区三区四那| 宅男免费午夜| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久久久久午夜电影| 中文字幕高清在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲欧美清纯卡通| 永久网站在线| xxxwww97欧美| av在线观看视频网站免费| 亚洲男人的天堂狠狠| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲avbb在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品伦人一区二区| 日本黄大片高清| 欧美成狂野欧美在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品成人久久久久久| 精品日产1卡2卡| 久久久久久久久大av| 国产久久久一区二区三区| 在线免费观看的www视频| 中文在线观看免费www的网站| 国产av不卡久久| 中文字幕久久专区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 中文字幕免费在线视频6| 91麻豆精品激情在线观看国产| 欧美中文日本在线观看视频| 黄片小视频在线播放| 久久久精品大字幕| 国产av不卡久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚州av有码| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲色图av天堂| 1024手机看黄色片| 国产乱人视频| 亚洲avbb在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 精品久久久久久久久av| 欧美不卡视频在线免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 直男gayav资源| 美女黄网站色视频| 国产精品亚洲美女久久久| 免费大片18禁| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲色图av天堂| 亚洲成人久久爱视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 在线播放国产精品三级| 亚洲自偷自拍三级| 搞女人的毛片| 男女之事视频高清在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 中出人妻视频一区二区| 久久国产乱子免费精品| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| 亚洲最大成人中文| 一个人观看的视频www高清免费观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 好男人在线观看高清免费视频| 91av网一区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 色综合站精品国产| 又紧又爽又黄一区二区| 真人一进一出gif抽搐免费| av国产免费在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产毛片a区久久久久| 国产精品久久视频播放| av在线观看视频网站免费| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日韩欧美三级三区| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲五月天丁香| 午夜免费成人在线视频| 婷婷丁香在线五月| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 男人的好看免费观看在线视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲精品456在线播放app | 美女黄网站色视频| 久久久精品大字幕| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产免费一级a男人的天堂| 精品人妻熟女av久视频| 一a级毛片在线观看| 亚洲第一电影网av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品亚洲一级av第二区| 成人av在线播放网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产 一区 欧美 日韩| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 男女床上黄色一级片免费看| 国内精品久久久久精免费| 亚洲黑人精品在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美极品一区二区三区四区| 90打野战视频偷拍视频| 国产熟女xx| 最近在线观看免费完整版| 热99在线观看视频| 国产精品一区二区免费欧美| 两个人视频免费观看高清| .国产精品久久| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美激情国产日韩精品一区| 成人性生交大片免费视频hd| 黄色女人牲交| 国产欧美日韩精品一区二区| 国模一区二区三区四区视频| ponron亚洲| 一本精品99久久精品77| 精品免费久久久久久久清纯| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲欧美精品综合久久99| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产美女午夜福利| 婷婷色综合大香蕉| 日韩欧美在线乱码| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲专区中文字幕在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 露出奶头的视频| 身体一侧抽搐| 在线播放国产精品三级| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 午夜福利成人在线免费观看|