張 良,韓 丹,趙詩萌,吳紅敏
(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院新生兒科,沈陽 110001)
動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是影響人類 健康最嚴重,最常見的心血管疾病之一,是人類當前死亡的一個主要病因。對免疫組織化學方法及超級形態(tài)學研究表明形成于AS病變早期的泡沫細胞主要是由單核細胞來源的巨噬細胞吞噬大量脂質(zhì)而形成的,而且存在于AS病變的始終,也有助于探索對AS病變的防治研究。其發(fā)病機制涉及炎性反應(yīng)、脂質(zhì)代謝失
調(diào)及氧化應(yīng)激等多種病理生理機制[1-3]。其中,低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的氧化修飾被認為是 AS形成的關(guān)鍵啟動因素[4].氧化性低密度脂蛋白(OX-LDL)與單核巨噬細胞間的相互作用是泡沫細胞形成的重要機制。目前已從細胞形態(tài)學,生物化學等方面對該問題進行了不同方面的闡述,但關(guān)于泡沫化過程中細胞內(nèi)脂質(zhì)變化情況的研究報道尚不多見。
本研究采用一次性密度梯度超速離心方法由健康成人血漿中分離出低密度脂蛋白,由硫酸銅溶液氧化24 h制備成氧化型低密度脂蛋白,同體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細胞相互作用,建立巨噬細胞源性泡沫細胞模型,并動態(tài)觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)成分(主要為總膽固醇TC、游離膽固醇FC、膽固醇酯EC)量的改變及細胞形態(tài)的變化過程,以初步探討單核細胞源性泡沫細胞形成的可能機制。
實驗動物,純系 615小鼠[5-6](遼實動質(zhì)字.(2000)015號),雄性 20~25 g,8~10周。健康成人新鮮血 200 mL(EDTA抗凝)固體 NaBr,固體CuSO4購于沈陽試劑三廠,分析純品 DMEM培養(yǎng)基(美國 Gibco,總膽固醇試劑盒及游離膽固醇試劑盒,購于北京天象人生物工程高技術(shù)公司,LDL標準品購于美國Sigma公司。
取新鮮全血室溫靜止后棄血凝于4℃,4 000 r/min離心30 min獲血清,加入0.05%NaN3,100 mg/L EDTA 防 腐、防 氧 化。再 于 4℃,12 000 r/min離心30 min后除去上層乳糜微粒(CM)后備用。配置密度液,以固體NaBr調(diào)整血清密度為1.3 g/mL,分別配制密度為1.2 g/mL NaBr,1.006 g/mL NaCl溶液及1.0 g/mL雙蒸水,(其中含0.01%EDTA,pH 7.6)用Abbe折光儀測定折光率,用CRC Handbook of Chemistry and Physics查得所對應(yīng)的密度,調(diào)整所配溶液的密度。按郭剛及 Byung H.的方法建立密度梯度于(10~15)℃,542 000 r/min(28 000 g)條件下超速離心5 h,吸出中間黃色液體為LDL(d=1.040 0~1.056 0),經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,LDL定量分析按Lowry方法測定蛋白含量,在Shimadzu UV-260紫外分光光度計上測595 nm處A值。LDL在4℃含10 mg/L EDTA的0.01 mol/L PBS中避光透析72 h,中間8 h換液一次,過濾除菌,4℃保存。
將LDL于0.01 mol/L PBS中充分透析24 h除去EDTA后放置于終濃度為5 μmol/L的硫酸銅溶液中 37℃ 氧化 24 h加入終濃度為 200 μmol/L EDTA終止氧化反應(yīng),而后于4℃含100 mg/L EDTA的0.01 mol/L PBS中透析24 h。用硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(thiobarbituric acid reactive substance,TABRS)的含量來鑒定LDL的修飾程度。采用方明的方法測定TBARS含量,總膽固醇的定量分析根據(jù)CHOD-PAP方法測得,LDL的氧化修飾程度以每克膽固醇的TBARS含量來表示。
取純系 615健康小鼠(雄性 20~25 g,8~10周)普通飼料喂養(yǎng)1周后將小鼠斷頸處死,消毒后腹腔內(nèi)注射無血清DMEM培養(yǎng)液5 mL,收集腹腔液以800 r/min離心10 min棄上清液收集細胞,用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度,以109/L密度種植在45 mL培養(yǎng)瓶中,每瓶約3 mL,在37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棄培養(yǎng)液,PBS沖洗掉未貼壁的細胞。分成3組,分別加入空白對照液(含 20%小牛血清,100 kU/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素DMEM培養(yǎng)液),含10 mg/L LDL及10 mg/L OX-LDL 培養(yǎng)液各 3 mL,繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72、96 h,另分為五組,分別加入含 10、30、50、100 μg/L LDL或OX-LDL培養(yǎng)液。
將培養(yǎng)后的細胞棄培養(yǎng)液用PBS沖洗3次,冰浴30 min后用橡皮刮子刮下細胞800 r/min離心10 min收集細胞,加入0.5 mL異丙醇,勻漿破碎細胞,800 r/min離心10 min取上清液用總膽固醇試劑盒及游離膽固醇試劑盒分別測定總膽固醇(TC)及游離膽固醇(FC)含量,沉淀用0.1 mol/L NaOH 0.2 mL裂解細胞,用Lowry法測得細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量。細胞內(nèi)膽固醇含量用每克蛋白所含的總膽固醇,游離膽固醇和膽固醇酯來表示,膽固醇酯(CE)含量由總膽固醇與游離膽固醇的差值來獲得。
將收集的腹腔巨噬細胞以109/L密度接種于3.5×1.5 cm2蓋玻片,實驗條件同前。培養(yǎng)結(jié)束后以PBS洗3次采用蘇丹III-IV混合染色的方法。
取培養(yǎng)24 h后的巨噬細胞PBS沖洗3次取下細胞離心收集,于細胞團塊中加入2.5%戊二醛4℃固定3 h,梯度丙酮脫水,樹脂包埋,切片后經(jīng)醋酸雙養(yǎng)鈾-枸櫞酸鉛雙重染色后,用JEM-2000EX透射電鏡攝片。
消化并收集細胞,以1 000 r/min離心10 min,棄上清,用 PBS沖洗 2次,然后加入 20 μL CD54、CD36抗體避光染色20 min,加入400 μL PBS置于流式細胞儀下進行檢測。
所有計量資料以均值±標準差表示,顯著性檢驗用配伍組設(shè)計的多個樣本均數(shù)比較的t檢驗
利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)采用5%分離膠,3%濃縮膠,以血清蛋白為對照鑒定所制備低密度脂蛋白,經(jīng)考馬氏亮藍染色為單一區(qū)帶,且位置與血清β-球蛋白位置相當,利用電子計算機圖像分析儀測定相對純度可達92.39%,蛋白含量為1.26 mg/mL,總膽固醇含量為60.85 mg/dL,基本上與以往文獻報道相符。LDL氧化修飾程度:LDL為2.87 μmol/g,OX-LDL 為 26.5 μmol/g(圖 1)。
圖1 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定、定量LDL和OX-LDLFig.1 Quantification of LDL and OX-LDL by polyacrylamide gel electrophoresis
為進一步研究低密度脂蛋白與氧化型低密度脂蛋白對巨噬細胞影響,我們進行了在不同時間(表1、圖2)、不同濃度條件下(表2、圖3)對LDL和ox-LDL對巨噬細胞進行了形態(tài)學分析(圖2~3)。
培養(yǎng)24 h后刮下貼壁細胞,經(jīng)電鏡觀察可見不同層面的細胞均呈現(xiàn)巨噬細胞的超微結(jié)構(gòu)特征,直徑大約為5~10 μm,邊緣犬牙交錯的細胞核周圍包含染色質(zhì),胞漿稀少含有大量的核糖體,線粒體豐富,同時還含有小的囊狀結(jié)構(gòu)及一定數(shù)目的致密顆粒,為溶酶體結(jié)構(gòu)。說明貼壁細胞基本上來源于小鼠腹腔巨噬細胞(圖4)。
圖2 不同時間條件下巨噬細胞形態(tài)學變化Fig.2 Morphological changes of macrophages at different time points
圖3 不同濃度巨噬細胞形態(tài)學變化Fig.3 Morphological changes of macrophages at different concentrations
表1 不同時間條件下巨噬細胞形態(tài)學變化Tab.1 Morphological changes of macrophages at different time points
表2 不同濃度下巨噬細胞形態(tài)學變化Tab.2 Morphological changes of macrophages at different concentrations
圖4 24 h后的巨噬細胞電鏡結(jié)果Fig.4 Electron micrographs of LDL-and ox-LDL-treated macrophages after 24 h
用無脂蛋白DMEM培養(yǎng)的單核巨噬細胞為對照培養(yǎng)組,實驗結(jié)果單核巨噬細胞與10 mg/L的LDL或OX-LDL孵育不同時間后,細胞內(nèi)的總膽固醇和游離膽固醇均較對照組明顯增加,且OX-LDL組比LDL組更為顯著。隨著時間的延長LDL組細胞內(nèi)總膽固醇,游離膽固醇的量保持相對恒定,而OX-LDL組細胞內(nèi)總膽固醇持續(xù)增加,游離膽固醇的含量基本不變,膽固醇酯的含量逐漸增加。最終表現(xiàn)為膽固醇酯在總膽固醇的比例增大約占50%左右,符合泡沫細胞的形態(tài)學及細胞學定義。
以不同濃度的LDL及OX-LDL同巨噬細胞培養(yǎng)48 h后,可見隨濃度的增加LDL組及OX-LDL組細胞內(nèi) TC、FC、CE均較對照組明顯增加,且 OXLDL組較LDL組更為明顯。其中LDL組在高濃度時仍表現(xiàn)為一定的飽和性,即 TC、FC、CE三者相對恒定,而OX-LDL組則表現(xiàn)為當濃度小于50 μg/mL時隨濃度的增加,細胞內(nèi)TC、FC、CE逐漸增加,在30~50 μg/mL時尤為明顯,當濃度大于 50 μg/mL時,隨濃度的增加細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量反而減少(圖5)。
圖5 不同時間 TC、FC、CE變化情況Fig.5 Expression of TC,F(xiàn)C,CE at different time points
本研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL能顯著誘導(dǎo)細胞表面CD54的表達,LDL誘導(dǎo)表達作用不明顯(圖6)。
圖6 LDL ox-LDL對細胞內(nèi)CD54變化影響Fig.6 Effects of LDL and ox-LDL on CD54 expression in the cells
本研究還進一步的觀察了細胞在LDL和ox-LDL慢性刺激下CD36的表達情況。在泡沫細胞的形成中,CD36介導(dǎo)的對修飾的 LDL(包括 Ox-LDL和乙酞化的LDL)的內(nèi)吞起著重要的作用,研究顯示,LDL,ox-LDL可以促進細胞膜表面受體CD36的表達(圖7)。
圖7 LDL ox-LDL對細胞表面受體CD36變化影響Fig.7 Effects of LDL and ox-LDL on CD36 expression in the cells
本文采用一次性密度梯度超速離心的方法,綜合以往文獻的經(jīng)驗,成功地由健康人血漿中分離出低密度脂蛋白,并在體外由Cu2+氧化制備成氧化型低密度脂蛋白,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳及測定TBARS含量鑒定其純度及氧化程度同以往文獻記載基本一致,滿足本實驗的要求。
統(tǒng)一培養(yǎng)條件下不同時間點培養(yǎng)的細胞內(nèi)總膽固醇的含量,OX-LDL組較LDL組增高,我們分析此現(xiàn)象原因有三,第一,可能是巨噬細胞對OX-LDL的攝取速度高于對LDL的攝取,由于OX-LDL其結(jié)構(gòu)的改變而使之與LDL受體親合性下降轉(zhuǎn)而通過與之具有更高親合性的清道夫受體特異性相結(jié)合,為巨噬細胞大量吞噬。第二,M體外培養(yǎng)的巨噬細胞中加入OX-LDL后可以刺激其產(chǎn)生巨噬細胞集落刺激因子(MCSF),MCSF可以在DNA水平促進SR基因表達,促使巨噬細胞對OX-LDL的攝入。第三,OX-LDL可以誘導(dǎo)一種細胞內(nèi)核受體 PPARr表達,該受體可以同編碼脂代謝有關(guān)的酶和蛋白的結(jié)構(gòu)基因結(jié)合,而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。而當巨噬細胞同OX-LDL相作用時,PPARr高水平表達直接作用于細胞表面CD36受體基因使之高水平轉(zhuǎn)錄翻譯從而使細胞表面CD36受體數(shù)目增多而使OX-LDL攝入量進一步增加。
巨噬細胞泡沫化過程中出現(xiàn)細胞內(nèi)堆積的脂質(zhì)逐漸增多,當堆積的脂質(zhì)超過了細胞的清除能力則形成特征性的巨噬細胞源性泡沫細胞。當巨噬細胞以胞飲的方式攝取大量 OX-LDL后,由于OXLDL其組成結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的改變,細胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝異常,OX-LDL-受體復(fù)合物首先進入溶酶體內(nèi),胞漿內(nèi)ACAT由于OX-LDL的進入而被激活,在ATP供能情況下將FC同油酸再次酯化,形成膽固醇酯,無法通過細胞膜排除細胞外,在電鏡下觀察為無膜包繞的脂滴形式存在于細胞內(nèi)。故在24~48 h,細胞內(nèi)CE較FC增加迅速,所占細胞內(nèi)總膽固醇比例高。隨著時間的延長,溶酶體內(nèi)來源于OX-LDL的神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin,SM)堆積,形成 SM-UC顆粒,使 UC不能通過溶酶體膜,溶酶體滲透性下降,SMase的活性而導(dǎo)致大量的非酯化膽固醇堆積于溶酶體內(nèi),而無法進入胞漿 FC代謝庫,使 CE生成下降,酯化作用減慢。故隨著時間的增加,表現(xiàn)為FC增加,而CE增加較明顯,但總膽固醇始終表現(xiàn)為增加。清道夫受體的表達與活性不受體內(nèi)游離膽固醇水平的負反饋調(diào)節(jié),因此可以無限制攝取氧化低密度脂蛋白,隨著OX-LDL的大量攝入,表現(xiàn)為OX-LDL分解減少,而以脂蛋白形式存在于細胞內(nèi),其apoB的抗原活性保留,同時含有以膽固醇酯為主的脂質(zhì)。因此表現(xiàn)為FC量基本不變,而CE量仍表現(xiàn)為增加,TC量增加。
研究發(fā)現(xiàn)OX-LDL中含有的過氧化產(chǎn)物LOOH及溶血卵磷酯對體外培養(yǎng)的巨噬細胞有毒性作用,可以破壞細胞的膜性結(jié)構(gòu),改變其通透性,從而使細胞壞死,脫壁。無論巨噬細胞是調(diào)亡還是壞死都是細胞代謝等一系列生命活動的終止,走向死亡的標志,在宏觀上表現(xiàn)為當 OX-LDL濃度〉50 μg/mL時,隨著濃度的增加細胞內(nèi) TC,F(xiàn)C及CE的量反而減少。此外,同一濃度下OX-LDL組較LDL組細胞內(nèi)脂質(zhì)含量明顯增高,說明OX-LDL較LDL更易使單核巨噬細胞形成泡沫細胞。
已有研究表明,巨噬細胞中的肌動蛋白一細胞骨架在動脈粥樣硬化脂蛋白膽固醇醋化中起著重要的作用。本研究表明,巨噬細胞中CD36介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞伴隨著 F-actni網(wǎng)絡(luò)的增加[7]。Ox-LDL顯著誘導(dǎo)CD36的提高。結(jié)果提示,在胞漿區(qū)局部F-actin的積聚不但存在己有肌動蛋白纖維的重新分布,而且也有新的actin多聚化產(chǎn)生。
ICAM-1即CD54是屬于免疫球蛋白超家族的一種細胞粘附分子,正常情況下僅在血管內(nèi)皮細胞較大量地持續(xù)表達,它與單核細胞表面的白細胞功能相關(guān)抗原LFA-I、巨噬細胞分化抗原 Mac-D以配體一受體的方式結(jié)合并參與介導(dǎo)單核細胞與血管內(nèi)皮細胞的粘附[8]。受炎癥因子、內(nèi)毒素等刺激后也可使單核細胞上微量表達的CIAM-1上調(diào),在多種細胞中發(fā)現(xiàn)人IAM-I的表達,包括內(nèi)皮細胞、單核細胞、淋巴細胞、濾泡樹突細胞、成纖維細胞和上皮細胞。本研究檢測了 LDL與 ox-LDL對細胞內(nèi)CD54的表達,結(jié)果顯示 ox-LDL可以增加細胞內(nèi)CD54表達,提示單核細胞的積聚可能隨ox-DLD增加而增加。
[1] Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Nature,1993,362(6423):801 -809.
[2] Katagiri H,Yamada T,Oka Y.Adiposity and cardiovascular disorders:disturbance of the regulatory system consisting of humoral and neuronal signals[J].Circ Res,2007,101(1):27-39.
[3] Glass CK,Witztum JL.Atherosclerosis:the road ahead[J].Cell,2001,104(4):503 -516.
[4] Steinberg D.Atherogenesis in perspective:hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime[J].Nat Med,2002,8(11):1211-1217.
[5] 李 莉,張錦,劉聰,等.致動脈粥樣硬化食小鼠的肝臟改變及其清道夫受體B1的表達[J].中國比較醫(yī)學雜志,2004,4(14):100.
[6] 盧笑叢,王有為.血脂類代謝研究中的轉(zhuǎn)基因動物模型[J].中國比較醫(yī)學雜志,2004,5(14):313-317.
[7] Vicca S,Massy ZA,Hennequin C,et al.Apoptotic pathways involved in U937 cells exposed to LDL oxidized by hypochlorous acid[J].Free Radic Biol Med,2003,35(6):603-615.
[8] Vijayagopal P, Srinivasan SR, Lipoprotein-proteoglycan complexes from atherosclerotic lesions promote cholesteryl ester accumulation in human monocytes/macrophages[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol 1992,12(2):237-249.