卵巢早衰動物模型制備研究進展

成 杰，丁利軍，胡婭莉

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京 210009;2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210008;3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科，南京 210008)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指發(fā)生在40歲以前女性的卵巢功能衰竭。近年來，POF的發(fā)病率逐年上升，已從不到1%［1］上升到約3.5%［2］。據(jù)統(tǒng)計，4% ～18%的繼發(fā)性閉經(jīng)患者及10% ～20%的原發(fā)性閉經(jīng)患者確診為POF，POF嚴重影響婦女身心健康和生活質(zhì)量，引發(fā)骨、心腦血管以及神經(jīng)系統(tǒng)等病變［3］。卵巢早衰是典型的異質(zhì)性疾病，由于病因復(fù)雜，機制尚且不明，為臨床治療帶來一定困難。建立一種理想可靠的卵巢早衰動物模型是研究卵巢早衰的重要手段，也是深入研究和探討卵巢早衰病因、發(fā)展、治療的基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外學(xué)者從卵巢早衰的發(fā)病原因出發(fā)，構(gòu)建了多種模型，但是對卵巢早衰模型建立的標準缺乏，部分模型重復(fù)性、穩(wěn)定性差。本課題組現(xiàn)將近年來較成熟的模型作一綜述。

1 自身免疫模型

1988年，LaBarbera等在臨床上發(fā)現(xiàn)自身免疫性卵巢疾病與部分女性卵巢早衰的發(fā)生相關(guān)［4］。Horejsi等通過調(diào)查原發(fā)性閉經(jīng)患者13例，發(fā)現(xiàn)其中5例患者抗透明帶抗體陽性，同時調(diào)查繼發(fā)性閉經(jīng)患者60例，有14例患者抗透明帶抗體陽性［5］。因此利用自身免疫性卵巢炎制備動物模型具有一定的臨床意義，其具體機制尚不明確，可能與調(diào)節(jié)性T細胞的缺乏有關(guān)，導(dǎo)致卵巢對自身抗體免疫反應(yīng)過強而產(chǎn)生自身免疫性卵巢炎，從而導(dǎo)致卵巢的損傷［6］。主要常見的造模方法有:

1.1 新生小鼠胸腺切除

Taguchi等摘除小鼠胸腺后3 d，通過間接免疫熒光法發(fā)現(xiàn)74%的B6A小鼠出現(xiàn)了抗卵巢抗體，92%的C31小鼠出現(xiàn)了抗卵巢抗體［7］;Tong等將剛出生2～4 d的幼鼠麻醉后切開胸骨，將兩片胸腺用玻璃吸管吸出后封閉切口，繼續(xù)與母鼠飼養(yǎng)，結(jié)果14 d后90%的幼鼠出現(xiàn)了自身免疫性卵巢炎并伴有卵巢早衰的表現(xiàn)，而且發(fā)現(xiàn)幼鼠產(chǎn)生一種大小為125 kDa的血清抗體，定位于卵母細胞質(zhì)中，命名為卵漿特異性抗體-1(ooplasm-specific protein 1，OP-1)［8］。

1.2 透明帶(zona pellucida，ZP)抗原免疫

1994年，Smith等首次報道了抗透明帶抗體(anti-ZP antibodies)與 POF 的發(fā)生相關(guān)［9］。Rhim 等以透明帶3抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生了自身免疫性卵巢炎，發(fā)現(xiàn)單次注射后，86%的B6AF1小鼠產(chǎn)生了卵巢炎，注射后第6天淋巴細胞充滿了卵巢的間質(zhì)區(qū)［10］。付莉等根據(jù)小鼠卵巢透明帶3的第330-342個氨基酸序列，合成透明帶多肽為免疫原，于小鼠雙后腳掌處進行皮下注射0.1 mL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%的模型組小鼠表現(xiàn)為性周期紊亂，其中50%無周期性、持續(xù)停留在動情期，80%的模型組小鼠出現(xiàn)外周血抗透明帶抗體陽性，90%的模型組小鼠發(fā)生自身免疫性卵巢炎［11］。

2 代謝模型

Guerreero等研究發(fā)現(xiàn)半乳糖血癥可導(dǎo)致育齡期女性原發(fā)及繼發(fā)性閉經(jīng)，不孕及卵巢早衰［12］。半乳糖血癥為一種常染色體隱性遺傳病，是由于半乳糖-1-磷酸鹽尿苷轉(zhuǎn)移酶(galactose-1-phosphate uridyltransferase，GALT)缺乏所致，其導(dǎo)致卵巢損傷的原因與半乳糖本身及其代謝產(chǎn)物對卵巢的損害有關(guān)［13］。Bandyopadhyay等通過外源性給予半乳糖的方法建立了大鼠 POF模型［14］。具體方法為:給予懷孕第3 d的SD大鼠飼料里添加35%的半乳糖至斷奶，發(fā)現(xiàn)胎鼠體內(nèi)原始生殖細胞明顯減少，同時發(fā)現(xiàn)實驗組幼仔發(fā)情期顯著推遲，F(xiàn)SH水平顯著上升，E2水平顯著降低，卵巢出現(xiàn)病理損傷，卵巢功能下降，對PMSG聯(lián)合hCG誘導(dǎo)的促排反應(yīng)明顯減弱［15］。李潔等選用8-12周齡的昆明小鼠，實驗組給予外源性補充半乳糖食物丸，對照組給予正常食物丸。在飼養(yǎng)70 d后實驗組卵巢縮小，重量為(0.0223±0.0032)g/卵巢，顯著低于對照組(0.0301±0.0055 g/卵巢，P＜0.001);實驗組血清E2為(2.979±0.393)pg/mL，顯著低于對照組(9.701±1.157)pg/mL，P ＜0.001;實驗組血清 FSH為(2.836±0.620)mIU/mL，顯著高于對照組(1.058±0.279)mIU/mL，P＜0.001。同時在第 50天和第70天行促排卵處理，和對照組相比，實驗組卵母細胞數(shù)目顯著減少［16］。

3 基因敲除(knock-out，KO)模型

基因敲除是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的分子生物學(xué)技術(shù)。目前最普遍的是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的?；蚯贸Ｐ鸵殉蔀檠芯炕蚪Y(jié)構(gòu)功能和建立人類疾病模型的一種常規(guī)實驗方法。近年來，POF基因敲除模型引起了越來越多的重視，與之相關(guān)的研究也成為熱點，為POF病因的闡述做出了重要貢獻，但尚不能完全解釋清楚POF病因。2010年Jagarlamudi曾綜述與POF相關(guān)的基因敲除小鼠模型［17］，結(jié)合最近新發(fā)現(xiàn)的基因，將與POF相關(guān)的主要基因敲除小鼠模型列表如下(表1)。目前研究比較確切的有PTEN敲除鼠和FOXL2敲除鼠等。Reddy等發(fā)現(xiàn)當小鼠PTEN基因敲除之后，原始卵泡池被激活，在出生后第23天時，敲除組已經(jīng)沒有明顯的原始卵泡，但是對照組仍有69.2%的卵泡為原始卵泡。小鼠在12周～13周之后變得不孕，敲除組血清 FSH和LH 水平也明顯增高(P ＜0.001)［18］。Schmidt等研究發(fā)現(xiàn)當小鼠體內(nèi)FOXL2基因突變后，小鼠顆粒細胞停止發(fā)育，卵母細胞逐漸閉鎖，8周時原始卵泡池耗竭，16周時卵巢無正常的卵母細胞和卵泡，致使小鼠不孕，說明FOXL2參與卵泡發(fā)育［19］。

表1 導(dǎo)致類似POF表型的候選基因小鼠敲除模型［17］Tab.1 KO mouse models exhibit phenotypes that are similar to POF in humans

4 抗腫瘤藥物模型

臨床發(fā)現(xiàn)血液病、腫瘤病患者在接受化療藥物治療后卵巢功能常受到損害［26］，如何恢復(fù)化療后育齡期婦女的生殖能力是目前關(guān)注的熱點，因此很多研究選擇化療藥物來構(gòu)建POF動物模型。比較常見的用于制備卵巢早衰動物模型的抗腫瘤藥物包括紫杉醇(paclitaxel)、順鉑(cisplantin)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)和雷公藤多苷(tripterygium glycosides)。

4.1 化療藥物模型

Fatih等發(fā)現(xiàn)，5－6周BALB/c小鼠腹腔分別注射2.5、5.0、7.5 mg/kg的紫杉醇7 d后，其原始卵泡數(shù)出現(xiàn)明顯變化，7.5 mg/kg紫杉醇組相比于正常對照組降低了36%(353.8±94.8 vs.227.7±45.8，P=0.001)［27］。Mehmet等則分別利用紫杉醇和順鉑建立大鼠POF模型，分別給予腹腔注射7.5 mg/kg紫杉醇和5 mg/kg順鉑，對照則腹腔注射滅菌生理鹽水。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，對照組的原始卵泡為23.07±16.11，而紫杉醇組為 10.3±13.04(P=0.001)，順鉑組為13.9±15.2(P=0.01)，均出現(xiàn)顯著下降，同時紫杉醇組和順鉑組相比差異沒有顯著性［28］。1999年Meirow等給小鼠注射環(huán)磷酰胺，發(fā)現(xiàn)對卵巢有損害，并且隨著濃度增大，卵巢的原始卵泡數(shù)越少［29］。何援利等腹腔注射環(huán)磷酰胺，負荷劑量50 mg/kg后以8 mg/kg.d的維持劑量連續(xù)注射14 d，發(fā)現(xiàn)大鼠卵巢功能明顯衰退，卵巢組織學(xué)及內(nèi)分泌改變與臨床卵巢早衰患者相似，大鼠動情周期在注射藥物7～10 d后發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為持續(xù)的動情間期、無動情前期或動情期。同時血清雌激素水平降低和FSH升高，大鼠的總卵泡數(shù)、次級和竇狀卵泡數(shù)明顯減少，閉鎖卵泡增多、卵巢間質(zhì)出現(xiàn)纖維化，卵巢功能損傷［30］。

4.2 雷公藤多苷模型

雷公藤多苷作為一種傳統(tǒng)中藥，具有免疫抑制、抗炎作用，目前主要應(yīng)用為自身免疫性疾病，如腎小球腎炎，類風濕關(guān)節(jié)炎［31］。近年來，由于其主要成分雷公藤內(nèi)酯醇具有抗胰腺癌作用引起國內(nèi)外的重視［32，33］。臨床上發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷具有明顯的生殖損傷作用，秦萬章等［34］報告育齡婦女長期服用雷公藤可導(dǎo)致月經(jīng)紊亂，月經(jīng)量減少，甚至閉經(jīng)。因此雷公藤多苷可用于制備卵巢早衰模型。Yu等用40 mg/kg·d雷公藤多苷給12周齡SD大鼠連續(xù)灌胃10周后，大鼠表現(xiàn)出卵巢衰竭的特征，表現(xiàn)出動情周期紊亂，延長至7～8 d，卵巢指數(shù)(ovarian index)的下降，模型組為 34.29±2.51 mg/100 g，明顯低于對照組(45.32±3.2 mg/g，P＜0.05);雌激素水平降低，正常對照組血清雌激素為57.27±4.61 pg/mL，而模型組血清雌激素明顯下降，為27.30±7.24 pg/mL，相比差異有顯著性(P＜0.05);抑制素B(inhibin B，INHB)水平也有明顯的下降，對照組為 21.45±6.99 pg/mL，而模型組為(13.36 ±2.93)pg/mL(P ＜0.05)［35］。高慧等比較了不同濃度雷公藤灌胃來構(gòu)建SD大鼠卵巢早衰模型的效果，發(fā)現(xiàn)50 mg/kg.d連續(xù)14 d灌胃后，卵巢組織中各級卵泡減少，部分卵泡內(nèi)可見淋巴細胞浸潤［36］。

5 小結(jié)

隨著對POF研究的逐漸深入，成功的POF動物模型愈發(fā)顯出其重要性。關(guān)于POF動物模型的報道并不少見，綜合起來較為常見的有自身免疫性疾病模型、半乳糖血癥模型、基因模型和化療藥物模型。這些方法其實都側(cè)重于不同的病因?qū)W，均有著各自的獨特性和局限性。

基因敲除模型優(yōu)勢在于能明確某一基因的作用，對闡述POF發(fā)生的機制有重要的作用，但是往往一種基因敲除模型只能解釋一個或者某幾個基因，而POF的發(fā)生不僅僅是一個基因的缺陷或突變導(dǎo)致的，因而不能完全解釋POF病因，在后續(xù)的治療及臨床意義方面有其局限性，同時又由于敲除小鼠模型成本較高，難以推廣。

半乳糖血癥為常染色體顯性遺傳病，該模型可以較好地使動物出現(xiàn)POF表型，但是半乳糖血癥在臨床中發(fā)病率很低，上海市新生兒篩查30余萬例中沒有出現(xiàn)半乳糖血癥患兒［37］，半乳糖血癥導(dǎo)致的POF臨床病例很少，缺乏實用的臨床意義。同時有文獻報道以半乳糖血癥為模型構(gòu)建的POF模型盡管卵泡數(shù)出現(xiàn)了明顯的下降，但是其生育能力是正常的［38］。

自身免疫性疾病和化療藥物模型目前國內(nèi)外研究都很多，堪稱經(jīng)典模型，都有著各自的臨床意義，可作為探討POF發(fā)病機制和病理改變的實驗性模型，但往往人們把關(guān)注的重點放在血清雌激素的變化和卵泡數(shù)的減少上，缺乏生育功能的研究。雷公藤作為傳統(tǒng)中藥，在構(gòu)建POF模型方面有重要的意義，同時由于其簡單易行，不失為一種較好的方法，但是目前缺乏可靠性及重復(fù)性，需要進行更進一步研究。

卵巢早衰目前臨床上缺乏明確的診斷標準，Shelling認為低于40歲的婦女因某種原因?qū)е碌拈]經(jīng)、低雌激素水平和高促性腺激素水平，伴隨著POF的進展出現(xiàn)不孕，可以診斷為 POF［39］。因此生育實驗在驗證POF模型中顯得尤為重要。我們認為良好的卵巢早衰模型應(yīng)包含下列幾個因素:(1)動情周期的改變;(2)血清雌激素明顯降低;(3)卵泡數(shù)顯著減少;(4)生育試驗證實產(chǎn)仔數(shù)明顯減少。以上4點符合人類POF疾病特征，反應(yīng)了卵巢早衰所導(dǎo)致的卵巢損傷。在實際研究中應(yīng)根據(jù)研究的條件和目的來選擇合理的POF動物模型，更好地進行POF機制、發(fā)展、治療的深入研究。

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