微生物法檢測實驗動物血清中的抗生素殘留

邢 進，馮育芳，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

抗生素殘留檢測主要有傳統(tǒng)微生物抑制法、氯化三苯四氮唑法、氣相色譜法、液相色譜法等。而微生物抑制法對儀器設(shè)備的要求不高，操作比較簡便，便于在國內(nèi)實驗動物檢測機構(gòu)中應(yīng)用。該方法最常用的嗜熱芽孢桿菌是被FDA認可的國際上公認的首選指示菌，其具有良好的培養(yǎng)穩(wěn)定性，對更多的抗生素敏感，敏感度也較高［1］。本研究旨在通過微生物抑制法對實驗動物血清中的抗生素殘留進行檢測，提高實驗動物微生物檢測結(jié)果的準確性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)CMCC 63509:由中國食品藥品檢定研究院食品化妝品檢定所惠贈。

1.1.2 血清:動物血清小鼠508份，大鼠91份，豚鼠386份，兔 334份，地鼠 40份，雞 10份，犬 229份，猴42份，共1640份實驗動物血清;新生牛血清(購自浙江天杭生物技術(shù)有限公司)。全部受試血清須經(jīng)56℃滅活30min。

1.1.3 抗生素:頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、亞胺培南、磺胺甲基異惡唑、慶大霉素、青霉素G、環(huán)丙沙星、多粘菌素 E(購自中國食品藥品檢定研究院);氯霉素、慶大霉素(購自天津藥業(yè)集團有限公司);利福平(日本 Wako)、紅霉素、四環(huán)素、新生霉素(美國 Amresco)，以上抗生素配制為 1000 μg/mL、500 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.025 μg/mL十個稀釋度。

1.1.4 試劑和器材:MH瓊脂培養(yǎng)基(美國BD);抗生素檢測試劑盒 Premi?test(德國拜發(fā))。牛津杯(內(nèi)徑6±0.1 mm，外徑 7.8±0.1 mm，高 10±0.1 mm)，90 mm無菌培養(yǎng)皿。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備:根據(jù)文獻［2］制備嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢懸液，將嗜熱脂肪芽孢桿菌60℃培養(yǎng)18～24 h后，轉(zhuǎn)入36℃培養(yǎng)3～4 d，革蘭氏染色鏡檢芽孢產(chǎn)率達到85%以上時，用滅菌PBS將菌苔洗下，80℃水浴10 min后加入到60℃預(yù)先制備好的MH 培養(yǎng)基中，至芽孢含量為 106個 /mL［3，4］。

1.2.2 雙碟的制備:取直徑100 mm，高20 mm的平皿，參考藥典中附錄IX A抗生素殘留檢查法［5］，將融化MH瓊脂10 mL在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作為底層。將制備好的50℃預(yù)熱的MH瓊脂菌懸液6 mL倒入預(yù)先凝固的MH底層瓊脂上，冷卻后備用。

1.2.3 血清中抗生素殘留的檢測:根據(jù)藥典［5］和相關(guān)抗生素殘留微生物學(xué)檢測方法國家標準［6］，參照管碟法檢驗該方法對不同抗生素的檢測限，并對照品各種實驗動物血清的抗生素殘留進行檢測。待嗜熱脂肪芽孢桿菌平皿凝固后，將牛津杯均勻放置在培養(yǎng)基上，每塊平皿放置6個。每個牛津杯中加入10 μL的受試血清，蓋好平皿，每塊平皿上設(shè)置陰陽對照各一個，陰性對照加入新生牛血清10 μL，陽性對照加入10 μg/mL青霉素 G。

1.2.4 與Premi@Test試劑盒檢測結(jié)果的比較:將本研究中所采用的嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法與Premi@Test抗生素檢測試劑盒的檢測結(jié)果進行比對［7］，比對樣品為14份抗生素對照品、82份隨機選擇的受試血清、4份新生牛血清陰性對照，將兩種方法獲得的結(jié)果進行比對，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.5 與細菌學(xué)檢測結(jié)果比對:在檢測血清中有875份的來源動物進行了腸道細菌的檢測，即用DHL瓊脂平皿對回盲部進行分離培養(yǎng)，將血清中抗生素殘留結(jié)果與腸道細菌學(xué)檢測結(jié)果進行比對，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 檢測限

從本研究所采用的嗜熱脂肪芽孢桿菌管碟法對14種抗生素對照品的檢測限可以看出，所用的嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株對頭孢菌素類抗生素、亞胺培南、青霉素G和環(huán)丙沙星最為敏感。但對氯霉素、磺胺甲噁唑和多粘菌素E敏感性較差，與文獻中的報道基本相符［8］。具體檢出限結(jié)果見表1。

表1 對不同抗生素的檢出限Tab．1 Detection limit of different antibiotics

2.2 重復(fù)性檢測

將選擇的14種抗生素及無抗生素的新生牛血清進行三次重復(fù)性試驗，陰性對照新生牛血清三次測試均無抑菌圈產(chǎn)生。14種抗生素三次測試的相對標準偏差RSD范圍在0.355% ～1.715%之間，表明該方法具有很好的重復(fù)性。結(jié)果見表2。

2.3 對實驗動物血清樣品的檢測

在對1640份實驗動物的血清進行檢測后，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬和猴的血清都發(fā)現(xiàn)存在對嗜熱脂肪芽孢桿菌不同程度的抑菌現(xiàn)象。小鼠血清樣品量最多，陽性率也最高。具體結(jié)果見表3。

2.4 與Premi@Test抗生素檢測試劑盒比較

本研究中采用的方法對頭孢他啶的靈敏度優(yōu)于Premi試劑盒，見表4。對動物血清的檢測結(jié)果Premi試劑盒的陽性率為21/83(25.3%)，本研究的檢測方法陽性率為31/83(37.5%)。如表5所示，兩種方法樣品結(jié)果總符合率為 72/100(72.0%)，X2=16.680，P ＞0.05，兩種方法的檢測結(jié)果差異沒有顯著性。

2.5 細菌培養(yǎng)與抗生素殘留的關(guān)系

在進行血清檢測的1640只實驗動物中，有875只的回盲部內(nèi)容物接種了DHL瓊脂平皿，檢測結(jié)果見表6。將菌落生長情況與抗生素檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析(X2=9.939，P＜0.05)，說明二者有一定的相關(guān)性，但C=0.106(＜0.4)，相關(guān)度不高。

表2 對抗生素對照品的重復(fù)性檢測結(jié)果Tab．2 Repeatability results of antibiotics reference substance detection

表3 實驗動物血清抗生素檢測結(jié)果Tab．3 Results of antibiotic residues test of the laboratory animal sera

表4 Premi抗生素檢測試劑盒對14種不同濃度抗生素的檢測結(jié)果Tab．4 Results of antibiotics test with Premi@Test kit to 14 different concentrations

表5 兩種方法檢測結(jié)果Tab．5 Results of microbial inhibition test and Premi@test

表6 血清中抗生素殘留與DHL瓊脂平皿檢測結(jié)果Tab．6 Results of antibiotic residues test and DHL plate test of the animal sera

3 討論

通過嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對實驗動物血清中的抗生素殘留進行檢測，發(fā)現(xiàn)在小鼠、大鼠、豚鼠、兔和犬中都有存在。特別是豚鼠、兔、犬的整體殘留水平更高，這可能與我國現(xiàn)行實驗動物微生物檢測國家標準中［9］，這些動物的普通級只須排除沙門氏菌有關(guān)。但藥物是否是經(jīng)由飼料、飲水，或是其他途徑進入動物體內(nèi)需要進一步確證。本研究采用的方法將微生物紙片抑制法和管碟法相結(jié)合，在保證敏感型的同時，彌補了實驗動物血清少的不足。與Premi@Test抗生素檢測試劑盒比較，結(jié)果基本吻合。

在檢測工作中，普通級動物的回盲內(nèi)容物、肛拭子或者新鮮糞便的檢測在接種DHL瓊脂培養(yǎng)基后，沒有細菌生長是非常普遍的情況。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生是否是由于飼養(yǎng)過程中使用抗生素所引起的，應(yīng)該引起我們的重視。從結(jié)果中顯示，DHL培養(yǎng)回盲部內(nèi)容物的菌落生長情況雖然與抗生素殘留情況有一定的相關(guān)性，但相關(guān)的程度很弱，這可能是因為停藥后一周內(nèi)，即便是之前連續(xù)使用用藥，大部分抗生素在畜禽體內(nèi)的水平也會降到檢出限以下甚至完全消除［10］。然而之前使用抗生素的效果會持續(xù)存在，干擾動物體內(nèi)的微生物菌群［11］，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，難以恢復(fù)［12］，極有可能對動物實驗造成影響。

在檢測成本方面，本研究所采用的微生物抑制法，將管碟法和紙片法相結(jié)合，非常經(jīng)濟，操作簡便，在實驗動物領(lǐng)域便于推廣。目前，我國實驗動物質(zhì)量抽查檢驗的機制仍存在許多需要改進的方面，檢驗標準的完善至關(guān)重要［13］。因此，為了保證實驗動物質(zhì)量檢測結(jié)果的準確，保證動物實驗，特別是藥品檢驗工作的順利進行，有必要增加對實驗動物抗生素殘留的檢測內(nèi)容，以確保實驗動物行業(yè)的健康發(fā)展。

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